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1、10.27.2016 周四下午 3:00-9： 30体外实验材料每人2个健康人外周血样本，每个样本2ml。样本为当天从瑞金医院取 得。主要溶液配制1. 1640完全培养基50ml准备一支50ml离心管，加入：改良型1640 （已含抗生素）20ml + 3种必 需氨基酸各500 ul + 1种盐溶液50 ul + 10%胎牛血清5ul +改良型1640, 定容至50ml。注意：氨基酸溶液、盐溶液枪头不能碰到管壁，胎牛血清枪头应 浸入混合液中。瓶口开着时手不能从上方飞过。2. 1x PBS 500ml用大量筒装ddH2O,分3次或以上用小量筒往PBS储存瓶中加450ml ddH2O,此前先倒入10
2、 x PBS 50ml,之后轻拧瓶盖（不要太紧，高压灭菌需要 略松），标记好1xPBS，瓶身上贴上灭菌黄条，使用前高压灭菌。3. FACs 50ml49ml 1 x PBS + 1ml 国产血清4. 2%多聚甲醛固定液50ml4%多聚甲醛 25ml + 1 x PBS 25ml实验操作1. 用3ml吸管吸取2ml PBS注入2ml的外周血样本中，吸管吹打后可插于装 样本的试管里。2. 15ml离心管饭盒中用镊子取2支，做好样本的对应标记，分别用吸管吸取 2ml Ficoll分离液于管中，再吸取上述外周血沿管壁缓慢加至Ficoll分离液 上层表面。离心2500rpm，20min，快升（9），慢降
3、（1）。3. 用镊子取2支新的15ml离心管，同样做好样本标记。从离心机中取出离心 后的离心管，用吸管小心吸取其中薄薄的一层白膜（注意只吸不打，不能吸 到下层Ficoll,上层可以带上一点），注入新的15ml离心管中。吸管可插于 管中。再用另一吸管吸取PBS至白膜（即PBMC）,定容至8ml,吹打。用 20 u l枪取17 u l样进行细胞计数，剩下样本离心，2000rpm, 10min （细胞 房内离心机，快升快降）。4. 结束后，倒去上清，每管各加入1640 1ml,吹打混匀。5. 支1.5ml Ep管，其中2管用于表面染色，另2管（无齿的进口管）用于 RNA抽提。每管均加入计算出的1M细
4、胞所需体积的细胞悬液。6. 3600rpm, 3min （每个样本的2支正好在离心时用于配平）。以下表面染色需避光操作：i. 配 Mix： 1 个样本需要50 ul FACs, 1ul 抗体 CD4, PD-1, CCR7,最终多加一个样本的量。加完后手指弹一弹。ii. 吸去上清（留下大约50ul）,刮，各加入50ul Mix，轻刮，室温避光染 色 15min。iii. 直接加 700 u l FACs 后，离心 3600rpm, 3min。iv. 吸去上清，各加入150 ul 2%多聚甲醛固定液，4C冰箱内保存。RNA抽提吸去上清（留一点），刮，分别加入500 u l Trizol裂解液，用
5、枪吹打混匀。- 20 C冰箱内保存。注意：1. 细胞计数：计数板和玻片，喷适量酒精，纸巾轻擦。盖好玻片，2个样本分 别吸取17ul于上下计数池中。上镜，选择黄线物镜（10x）观察。用计数 器辅助计数。选择每个池中左上和右下两个大格计总和后除以2记为N,则 计算公式为：a）细胞浓度=N x 104x 8ml x稀释倍数b） 1M细胞所需体积=1/细胞浓度（M/8ml）2. 灭菌时需在comlpeted状态且温度在60C以下才能打开仪器，有溶液需灭菌 时选用liquid模式，设置121C, 20min, start （整个过程需2h）。PBS溶液灭菌后应放在超净台上冷却至室温（注意瓶盖仍然略松，锡
6、纸不要拿下），冷却后拧紧瓶盖，锡纸待用时再拿下，置于4C冰箱冷藏。离心管饭盒都应 在灭菌前贴上灭菌条，每盒内放置同一类型离心管，以7个为宜。枪头盒也 应灭菌。3. CD4抗体存放于细胞房内冰箱内的蓝色盒子内，PD-1、CCR7标记好RBL 字样后存放于4th冰箱内4C保存。4. 超净台使用完毕后应整理台面，废弃的塑料管倒入黄色垃圾箱，吸管塑料袋 可弃于一般垃圾桶内，各试剂瓶确认瓶盖拧紧以后拿至冰箱内存放。移液枪 调至最大量程后挂于枪架上。酒精擦洗台面，关闭台窗，打开紫外线自动杀 菌。数据记录样本1 （乔：2ml，PBMC浓度为4.8M，1MPBMC所取体积为208 u 1）样本2 （程：2ml，PBMC浓度为4.64M，1M PBMC所取体积为216 ul）
