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1、大鼠牙囊细胞培养方法的讨论【摘要】【目的】讨论大鼠牙囊细胞体外培养的方法。【方法】别离出大鼠牙囊组织，分别采用组织块培养法、细胞消化分散法、及改进组织块法进展牙囊细胞原代及传代培养，倒置相差显微镜下进展细胞形态学观察，透射电镜观察细胞超微构造。【结果】培养至第3天，倒置相差显微镜观察发现，采用组织块培养法，见少数细胞从组织块爬出；而细胞消化分散法那么可获得数量多的牙囊细胞，但与杂质细胞混杂生长；改进组织块法见量多、相对纯的牙囊细胞。电镜下牙囊细胞无桥粒，胞浆中含有高密度电子颗粒和大量粗面内质网。组织块法、细胞消化分散法和改进组织块法牙囊细胞培养成功率分别为80%、60%和100%；分别于10d
2、、7d和6d左右进展第一次传代。【结论】改进组织块法是一种良好的大鼠牙囊细胞培养方法。【关键词】牙囊细胞；细胞培养；方法学Abstrat：【bjetive】Texplretheultureethdfratdentalfllileellsinvitr.【ethds】Thedentalfllile(DF)tissueseredissetedfrpriarygeneratinandpassageulturebyethdsfexplant,dissiatinellandiprvedexplant,respetively.nsequently,therphlgyftheulturedfirstpassa
3、geDFellsandthEirultrastrutureeredisveredunderinversinphasediffereneirspeandtransissineletrniirspe,respetively.【Results】Atthethirddayinvitr,nlyafeellsextendedfrtheexplantbyayfexplant,andanyDFellsixingithipureellsadheredallbyayfdissiatinell.Hever,alargequantityfrelativepureDFellsasdisveredbyayfiprvede
4、xplantatthesaetie.Transissineletrnirspyshedthattheulturedellsntainedeletrn-densegranules,andabundantrughendplasiretiuluRERandndesses.Atabut10th,7thand6thdayinvitr,DFellserepassedfirsttieithahieveentratifeighty,sixtyandnehundredperentbyaysfexplant,dissiatinellandiprvedexplantulturerespetively.【nlusin
5、】IprvedexplantultureasagdulturingethdfrratDFells.Keyrds:dentalfllileells；ellulture；ethdlgy牙囊对牙齿萌出起重要作用。牙萌出必须是在牙槽骨的吸收、形成牙槽骨的通道后，才可以完成这一生理过程1。ahill和arks2，3研究说明，以手术方法去除小鼠牙囊，牙齿那么不能萌出；而保存牙囊，用其它物质替代牙胚，结果替代物可以萌出。Larsn4在狗前磨牙牙冠形成后萌出前四周去除牙囊，牙齿同样不能萌出，将剥离的牙囊立即放回成釉器外表，牙齿即能重新萌出。这些研究证明牙齿萌出依赖牙囊的存在。牙囊在牙齿萌出过程中，从组织、细胞
6、和分子程度上对牙齿萌出起重要的调控作用5，6。目前关于牙囊细胞的体外培养，国内外报道尚不多7。本研究以SD大鼠为实验对象，采用组织块培养法、细胞消化分散法及改进组织块法培养大鼠牙囊细胞，比拟不同方法的优缺点，以寻求培养牙囊细胞的最正确方法，为研究牙囊在牙齿萌出过程中的作用在细胞方面提供根据。1材料和方法1.1试剂、仪器及动物实验来源E培养基GIB公司，美国，胎牛血清杭州四季青生物材料，HEPESSiga公司，美国，胰蛋白酶AdvanedTehnlgyIndustrialpany，左旋谷氨酰胺GIB公司，美国，青霉素、链霉素华北制药股份，丙酮酸钠Siga公司，美国，PBS北京中山生物技术，细胞培
7、养瓶rning,USA，超净工作台苏州安泰空气技术，细胞培养箱Sany,Japan，倒置相差显微镜Leia,Gerany，SD乳鼠中山大学动物实验中心。1.2牙囊组织的别离与获取取5只新生6或7d的SD乳鼠，引颈法处死后，用75%酒精浸泡23s，外科法取出下颌骨，置入D-Hanks平衡盐溶液含300U/L青霉素，300g/L链霉素，在解剖显微镜下别离出下颌第1、第2磨牙牙胚。进一步在解剖显微镜下别离牙囊与成釉器，将别离出的牙囊组织立即置入E培养基中含300U/L青霉素，300g/L链霉素，pH7.2。用眼科剪将组织块切成12大小的块。1.3牙囊细胞原代培养1.3.1组织块培养法将上述方法获得的
8、组织块离心5in，弃上清液，参加12%E培养基0.5L，转入252培养瓶中，用弯头吸管把组织小块摆布在培养瓶底上。小块互相间隔 0.5，轻轻翻转培养瓶，使牙囊组织贴附在培养瓶底，置入细胞培养箱中，于体积分数5%2、37饱和湿度条件下培养。12h补加1.5L培养液，23d换液1次，细胞长满后传代，以1.25g/L胰蛋白酶和0.025%的EDTA11液消化。1.3.2细胞消化分散法用眼科剪将组织块切成12大小的块，离心5in，弃上清液。1.25g/L胰蛋白酶消化10in，待组织块分散成细胞团或单个细胞，再次离心5in，弃上清液，参加12%E培养基2L，置入252培养瓶中，体积分数5%2、37饱和湿
9、度培养。23d换液1次，细胞生长形成单层后常规消化传代。1.3.3改进组织块法采用细胞消化分散法与组织块培养法相结合法，用眼科剪将组织块切成12大小的块，离心5in，弃上清液。1.25g/L胰蛋白酶消化5in，再次离心5in，弃上清液，参加12%E培养基0.5L，转入培养瓶，体积分数5%2、37饱和湿度条件下培养，12h后补加12%E培养基1.5L。23d换液1次，细胞生长形成单层后常规消化传代。1.4牙囊细胞的传代培养上述3种培养方法分别重复5次实验。将上述方法培养的原代细胞分别进展传代培养。弃去培养瓶内培养液，D-Hanks平衡盐溶液洗涤细胞。参加1.25g/L胰蛋白酶和0.02%EDTA
10、11液2L。倒置显微镜下观察，梭形细胞在12in内收缩变圆，细胞互相别离。此时立即吸出消化液，参加12%E培养液4L以终止消化。用弯头吸管汲取瓶内培养液，反复吹打10次左右，使细胞脱离瓶底形成细胞悬液。将细胞悬液按12进展培养，培养条件与原代一样。1.5透射电镜观察牙囊细胞搜集第3代细胞，参加2.5%戊二醛0.1l/L磷酸缓冲液，pH7.4，含有2.5l/L的氯化钙固定15in。将全部细胞搜集在锥形离心管内，经2000r/in离心15in成团。将团块转移至1.5LEP管内，经3000r/in离心10in使细胞沉淀结块。用冷蔗糖缓冲液洗团块1h，4条件下1%饿酸固定12h；体积分数50%、70%
11、和90%丙酮脱水各1015in，体积分数100%丙酮脱水3045in。浸入11丙酮包埋剂混合液，室温下放置1h。浸入环氧树脂3724h，60固化48h。A切片机做超薄片切，制备电镜标本。标本用饱和醋酸铀水溶液染色1015in，柠檬酸盐染色510in。透射电镜下观察、拍照。2结果2.1不同方法培养的原代牙囊细胞组织块法培养牙囊细胞，见组织块4h贴壁，24h见个别细胞从组织块中爬出，呈贴壁型生长，第3天时从组织块中爬出的细胞数量逐渐增多图1，呈两种细胞形态。一种细胞呈梭形，中央有卵圆形核；另一种为上皮型细胞，呈扁平不规那么多角形，中央有圆形核，且核较大。细胞消化分散法培养牙囊细胞，可见细胞6h贴壁
12、，24h半数以上细胞恢复形态，呈梭形或扁平多角形，两种形态细胞混杂生长图2。改进组织块法培养牙囊细胞，可见消化后的组织块呈絮状，组织块4h贴壁，24h可见细胞从组织块中爬出，培养至第3天时，组织块周围有大量梭形或不规那么三角形细胞，呈放射状或旋涡状走形，为典型的成纤维细胞表现图3。梭形细胞周围有上皮型细胞，随着梭形细胞增多，上皮型细胞数量也增多，并逐渐交融成单层细胞图4。2.2细胞的传代和纯化将3种方法获得的原代细胞，均采用胰蛋白酶和EDTA混合消化法传代，注入酶23in，即可见成纤维细胞样细胞胞质回缩，胞体趋于变圆，细胞间隙变大、别离。上皮样细胞那么无上述变化。此时及时中止消化，进展吹打。将
13、吹打脱落的细胞置入新培养瓶6h后，细胞恢复形态，呈梭形或不规那么三角形，并且局部开场分裂增生。改进组织块法培养6d左右第一次传代，传代培养至第6天见生长活泼的第2代牙囊细胞图5，传至第3代时，可得到纯化的牙囊细胞。2.3透射电镜下超微构造细胞细长，两极明显。胞浆中含有丰富的粗面内质网rughendplasiretiulu,RER，并在细胞两极处消失，有的RER囊状扩张，含有大量絮状物质，偶见高密度电子颗粒图6。2.4三种方法培养结果的比拟采用3种方法各作5次培养，培养过程中细胞消化法出现2次污染，7d左右牙囊细胞增殖形成单层并进展第一次传代，成功率为60%；组织块培养法未出现污染，出现一次组织
14、块未贴壁，10d左右进展第一次传代，成功率为80%；改进法培养过程中未出现污染，6d左右进展第一次传代，成功率为100%。3讨论牙囊起源于外胚间充质，是包绕在成釉器外围的一层致密的结缔组织，在牙齿发育后期形成牙骨质、牙周膜和固有牙槽骨。在牙齿发育及萌出过程中，牙囊细胞在上皮根鞘及牙乳头细胞的诱导下分化形成牙骨质细胞、成纤维细胞及成骨细胞，分泌牙骨质基质、胶原纤维、骨基质，最终形成牙周组织8，9。有文献报道，体外培养的牙囊细胞具有某些成牙骨质、成骨样细胞表型10，最近有学者从永生化的牙囊细胞中别离出了成牙骨质的祖细胞成份7，进一步说明牙囊在牙齿萌出过程中，从组织、细胞和分子程度上对牙齿萌出起到重
15、要的调控作用。牙囊细胞的体外培养是研究牙齿萌出过程中分子调控作用的细胞学基矗体外培养牙囊细胞采用的动物模型主要有狗、小鼠和大鼠。文献报道中仅见牙囊细胞的细胞消化培养法4，细胞消化分散法是用胰蛋白酶分解牙囊组织，使之分散成牙囊细胞团或单个牙囊细胞，然后进展原代培养。由于该方法在消化别离过程中细胞损伤大，可影响细胞的贴壁和成活率，此外消化分散法获得的细胞中，往往由于消化得到单个细胞或者小的细胞团，因此容易混杂有杂质细胞，不利于牙囊细胞的纯化，在本实验中观察到混杂有较多的上皮细胞，获得的牙囊细胞纯度不高。本实验尝试采用组织块培养法培养大鼠牙囊细胞，并进一步探索出改进组织块培养法，因此作者尝试采用组织块培养法是将牙囊组织剪切成1大小的组织块，使之贴附于培养瓶底，待细胞从组织内爬出、生长以获得原代细胞，该方法获得的牙囊细胞纯度较高，但在实验过程中观察到：组织块接种后难免翻动和振动，使组织块不易贴壁；参加培养液后，受浸泡的组织块受液体细微的波动及浮力作用易脱落下来，即使贴壁也难以生长；处于组织团块中心的细胞因营养穿透有限而代谢不良、生长缓慢，因此获得的牙囊细胞数量较少。因此培养效率降低，成功率为80%。改进法是结合消化分散法和组织块法来培养牙囊细胞，同组织块培养方法一样，获得12的牙囊组织块，但是将细胞分散法中的胰蛋白酶消化组
