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1、培养观察细菌的简易方法一、牙垢中的细菌 用消毒牙签，在自己牙齿缝里挑下一些碎屑，放在洁净载玻片上的水滴中，调匀，制成涂片。待涂片干燥后，在酒精灯火焰上徐徐来回掠过34次，细菌外面的一些胶质粘着在载玻片上，使细菌固定、稍冷，加一滴亚甲基蓝溶液，染色12分钟后，用清水冲洗，然后盖上盖玻片。置显微镜下，先用低倍镜观察，再换高倍镜，可观察到杆菌、弧菌、球菌等。若使用油镜观察，效果更清楚明显。 二、粪池里的细菌 在粪池用吸管吸取一滴沤过的粪混合液上层液体，滴在洁净的载玻片上，盖上盖玻片。置显微镜下观察，先用低倍镜，后用高倍镜。可见到活的螺旋菌及杆菌。注意在观察时光线应暗些，效果好。 三、酸莱、酸奶中的细
2、菌 取酸菜液上部的白色薄膜或酸奶澄清液，制成临时装片，放在高倍镜下观察，可看到乳酸杆菌。 四、根瘤菌的观察 取豆科植物大豆、蚕豆、花生的根瘤用刀片切开，用针挑取一小块内容物，放在载玻片上的水滴中，制成涂片，晾干后，用酒精灯火焰烘烤固定，然后滴一滴亚甲基蓝溶液，染色23分钟，清水冲洗，盖上盖玻片，吸干后，用500倍高倍镜观察，可见到短杆状根瘤菌。 五、枯草杆菌的培养和观察把25克新鲜干草切成小段，放在盛200毫升清水烧杯中，加热煮沸15分钟，待溶液呈暗褐色时，倒入烧瓶，放在黑暗、2030的温暖环境中。23天后，液体混浊，表面形成薄膜。用吸管吸取浮在上层的液体，制成临时涂片，放在高倍镜下观察，可看
3、到连成线的枯草杆菌。若将培养液放在低温处12天，再取出制成临时涂片，用600倍或更高倍数的显微镜观察还能看到枯草杆菌的芽孢。微生物学实验 细菌细胞的生化反应实验 一、实验目的 了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法。 二、实验原理 各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以利用相同的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别细菌。 糖发酵是最常用的生化反应，存在于大多数细菌中。不同的细菌在糖的分解能力上存在很大的差异。有些细菌能分解某种糖并产生酸性物质(如乳酸、丙酸、醋酸等)和气体(如二氧化碳、氢、甲烷等)，而有些细菌只产生酸不产生气体。例
4、如大肠杆菌分解乳糖和葡萄糖产酸并产气，普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，但不能分解乳糖。酸的产生可利用指示剂来判断。在培养基中加入溴甲酚紫(pH52为黄色，pH68为紫色)，当发酵产酸时，使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵试管中倒置的德汉氏小管中有无气泡的出现来验证 三、试剂与器材1.材料大肠杆菌、普通变性杆菌、产气杆菌、糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基。2.试剂甲基红试剂、40KOH、5a一萘酚、乙醚、吲哚试剂。3.实验器材德汉氏小管、试管、接种环、恒温培养箱。 四、实验内容培养基配制编号试管接种培养观察结果 五、关键步骤及注意事项1.要严格按照培养基配方配制培养基。
5、2.观察结果时要注意滴加药量及反应时间。 六、思考题1.哪些生理生化试验可用于区别大肠杆菌和产生肠杆菌?结果如何?2.做糖发酵试验时应注意哪些问题?3.甲基红试验和伏一普试验的最终产物如何?为什么会出现不同的最终产物?微生物学实验 微生物直接计数法及测微技术 一、实验目的1.了解血球计数板计数原理，并掌握计数方法。2.掌握用测微尺测定微生物大小的方法。 二、实验原理 显微镜直接计数法是将一定稀释的菌体或孢子悬液注入血球计数板的计数室中，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。因为计数板是一块特别的载玻片。其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有
6、一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格(见图2344)；另一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小方格，无论哪种每个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为01mm，所以计数室的容积为01mm3。计数时，通常只用5个中格内的菌体(孢子)数即可。然后求出每个中方格的平均值，再乘上25或16，得出一个大方格中的总茵数，再换算成lml菌液中的总菌数。若设5个中方格中总菌数为N，菌液稀释倍数为M，如果是25个中方格计数板，则计算方法为：lml菌液中的总菌数=平均每个中格中菌的个数25104M=50000NM(个
7、)微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格，每格长001mm(即10pm)。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。 三、试剂与器材1.材料 酿酒酵母、藤黄微球菌和大肠杆菌的染色标本片、酿酒酵母24h马铃薯斜面培养物。2.实验器材 细胞计数板、显微镜、盖玻片、无菌毛细滴管、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、盖玻片、显微镜等。 四、实验内容1.微生物直接计数法 菌悬液制备镜检计数
8、室加样品显微镜计数清洗血细胞计数板2.微生物测微技术 装目镜测微尺校正菌体大小测定 五、关键步骤及注意事项1.防止加样空气泡产生。2.调节显微镜光线的强弱适当。 六、思考题1.根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差、力求准确?2.某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计12种可行的检测方法。3.为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正?微生物学实验 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定 一、实验目的1.观察酵母菌的形态特征、出芽生殖方式，并掌握酵母菌与细菌形态特征的区别。2.学习鉴别死活细胞的实验方法。 二、实验
9、原理 酵母菌是单细胞的真核微生物，菌体比细菌大而且不运动。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种，以无性繁殖为主。芽殖是酵母菌普遍的无性繁殖方式，少数为裂殖；有性繁殖是产生子囊和子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和芽殖方式。 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。 三、试剂与器
10、材1.材料 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡尔酵母(Saccharomyces calsbergensis)培养2天左右的麦芽汁(或豆芽汁)液体培养物。2.试剂 0.05和O.1吕氏碱性美蓝染色液、革兰氏染色用的碘液。3.器材 显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、洒精灯等。 四、实验内容1.美蓝浸片观察 酵母培养制片染色镜检30分钟后再镜检2.水-碘浸片观察 五、关键步骤及注意事项1.染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液溢出或出现大量气泡。2.用镊子取一块盖玻片，先将一侧与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，使其盖在菌液上，盖玻片不宜平着放下，避免气泡产生。
11、六、思考题1.吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响?试分析其原因。2.在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌?微生物学实验 常用培养基的制备、灭菌与消毒 一、实验目的了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。 二、实验原理培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的
12、细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。 三、试剂与器材1.器材 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。2.试剂 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 四、实验内容1.称量溶化调pH过滤分装加塞包扎灭菌无菌检查2.干热灭菌：装入待灭菌物品升温恒温降温开箱取物3.高压蒸汽灭菌：加水装物品加盖加热排冷空
13、气加压恒压降压回零排汽取物无菌检查4.过滤除菌：组装灭菌连接压滤无菌检查清洗灭菌 五、关键步骤及注意事项1.要严格按配方配制。2.调pH不要过头。3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70C以下放物、取物。4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清洗保存。 六、思考题1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的?2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么?3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么?4.培养基的配制原则是什么?如何做好鞭毛染
14、色细菌鞭毛染色制片技术是微生物学的重要实验。鞭毛着生的位置和数目是种的特征，对细菌分类具有重要意义。鞭毛是细菌的运动“器官”。细菌的鞭毛极为纤细，一般直径只有1020m，只有用特殊的鞭毛染色法进行染色，才能在光学显微镜下观察；鞭毛染色法的原理是借助媒染剂和染色剂的沉淀作用，使染料沉淀在鞭毛上，使鞭毛直径增加并着色。 鞭毛染色前几年多用利夫森（Leifson）氏鞭毛染色法，近年来多用硝酸银染色法。不论用哪种方法都具有实验技术要求高、过程复杂、难度较大的特点，故鞭毛染色常常效果不太理想。下面就如何做好鞭毛染色谈几点意见供参考。 1要选好菌种。一般用周生鞭毛菌（如普通变形杆菌Proteus vulg
15、aris）较好，这类菌的鞭毛多而长易于观察。 2要注意培养条件和培养时间：用点接法在新配制的牛肉膏蛋白胨半固体平板上接种。一般一个平板点接34处。经比较用半固体培养基培养出来的菌体活动度大，鞭毛长且多，易于染色，这可能与半固体培养基更适于菌体运动、鞭毛生长较好有关。用点接种法在平板上接种更易于挑取边缘幼龄的菌体。培养时间要严格掌握，一般培养912h较好，菌龄超过15h，鞭毛染色效果较差，这可能与老龄菌体活动度降低、鞭毛易脱落有关。冰箱长期保存的菌种不宜直接用于鞭毛染色，需用新制备的斜面连续转接23次后再染色。 3所用玻片的准备：用过的旧载片要选择光滑无划痕的，放入已加入洗衣粉的蒸馏水中煮沸（如能预先过滤去渣更好），煮毕冷却后，清水洗净，放入浓洗液中浸泡24h，取出用清水冲洗残酸，最后用蒸馏水洗净，沥干水并放于95乙醇中脱水，取出后烧去酒精，即可使用。新的载片虽没有油污、划痕，但
