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1、第一章细菌学(bacteriology)是微生物学的重要组成部分，也是分子生物学和生物工程学的不可分割的重要内容。细菌具有体积小、繁殖快、代谢类型多样、易变异、易人工分离培养等特点，它代表了生命存在的最简单模型；易于用形态染色、生化反应、血清学试验、动物接种等方法鉴定，微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称.形体微小，结构简单，通常要用光学显微镜和电子显微镜才能看清楚的生物，统称为微生物。生物安全从业人员处理生物危害材料时的措施，以避免感染自己、他人或环境。生物安全性(biological safety)是指用生物学技术(biotechnology)从事研究、开发、生产到实际应用等全过
2、程中所涉及到的安全问题。实验室生物安全防护(biosafety protection for laboratories)是指实验室工作人员所处理的实验对象含有致病的微生物及其毒素时，通过在实验室设计建造、使用个体防护设施、严格遵从标准化的工作及操作程序和规程等方面采取综合措施，确保实验室工作人员不受实验对象侵染，确保周围环境的生物安全。 在细菌学实验室中，实验操作人员应严格遵循三条通用原则1.积极防止操作者在污染的环境中接触生物危害物；2.主动封闭生物危害材料产生之源，防止从操作部位向周围环境释放；3.尽量减少生物危害材料向周围环境意外释放所造成的后果。生物安全实验室生物安全实验室实质是指:通
3、过规范的实验室设计建造、实验设备的配置、个人防护装备的使用（硬件）严格遵从标准化的操作程序和管理规程等（软件）。确保操作生物危险因子的工作人员不受实验对象的伤害，确保周围环境不受其污染,确保实验因子保持原有本性所采取综合措施的实验室。 生物安全实验室三项技术措施样品隔离技术（机械、气幕），防止传染因子进入环境接触人体定向流技术（三级负压系统），防止传染因子扩散消毒灭菌技术（物理、化学），灭活传染因子生物安全防护三原则（三要素）实验室生物安全防护的内容包括：1.安全设备、个体防护装置和措施（一级防护）2.实验室的特殊设计和建设要求（二级防护）3.严格的管理制度和标准化的操作程序和规程等方面采取综
4、合措施来达到：确保实验室工作人员不受实验对象侵染，确保周围环境不受其污染的目的 。一级屏障（primary barrier）是操作者和被操作对象之间的隔离，也称一级隔离二级屏障(secondary barrier) 生物安全实验室和外部环境的隔离，也称二级隔离 微生物危害评估(hazard assessment for microbes) :对实验微生物和毒素可能给人或环境带来的危害进行评估 生物安全柜(biosafety cabinet)是处理危险性微生物时所使用的箱形空气净化安全装置 一般细菌等微生物实验室常用基本设备包括：培养箱（普通培养箱、真菌培养箱和厌氧培养箱）、恒温水浴箱、恒温干燥
5、箱、冰箱，高压蒸汽灭菌器，生物安全柜，显微镜（暗视野显微镜、荧光显微镜和显微摄影装置），离心机，电动匀浆器，薄膜过滤装置以及无菌室使用的主要仪器设备等 生物安全实验室配置要求级别 配备基本要求一级 按一般生物实验室基本配备二级 按一般生物实验室基本配备，加上生物安全操作柜三级 除上设备外，专设有缓冲区、负压实验室区、高压灭菌装置、排气净化系统四级 专设缓冲区、淋浴室、负压实验区、 高压灭菌装置、排气净化系统、污水处理系统微生物危害等级GB 19489-2004实验室 生物安全通用要求 分级依据微生物的致病性；传播方式和宿主范围；具有的有效预防措施；具有的有效治疗措施危险等级I （低个体危害，低
6、群体危害） ：不会导致健康工作者和动物致病的细菌、真菌、病毒和寄生虫等生物因子 。危险等级 (中等个体危害，有限群体危害) ：能引起人或动物发病，但一般情况下对健康工作者、群体、家畜或环境不会引起严重危害的病原体。实验室感染不导致严重疾病，具备有效治疗和预防措施，并且传播风险有限 。危险等级 III （高个体危害，低群体危害）：能引起人类或动物严重疾病，或造成严重经济损失，但通常不能因偶然接触而在个体间传播，或能使用抗生素、抗寄生虫药治疗的病原体。 危险等级 (高个体危害，高群体危害)：能引起人类或动物非常严重的疾病，一般不能治愈，容易直接或间接或因偶然接触在人与人，或动物与人，或人与动物，或
7、动物与动物间传播的病原体。微生物危害等级(国务院条例) 病原微生物实验室生物安全管理条例 分级依据病原微生物的传染性、感染后对个体或者群体的危害程度将病原微生物分为四类一类是指能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物二类是指能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物 三类是指能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物四类是指在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物细菌等微生物实验室守则（一）
8、为确保实验室整洁、个人及他人安全，以及实验顺利进行，书包和各类非必要的物品一律不得带入实验室内。（二）在进行每一实验之前，应预习实习指导并清楚实验的目的、内容，所依据的原理、采用的方法和基本要求。（三）实验进行过程中，应尽量避免在实验室内走动，不得高声谈话，保持室内安静。防止造成大量尘埃、气溶胶而导致污染。（四）各种仪器设备的使用必须严格按照说明书或已定出的操作步骤及要求进行。各种废弃物品应按要求放入指定位置有标识的容器内。（五）实验操作要轻柔、细心谨慎，并认真细致观察，如实作好实验记录。（六）实验中发生和出现操作失误、实验材料泄漏等事故应立即向指导教师报告，并在老师指导下采用合适的方法作及时
9、消毒和去污染处理。（七）实验中凡用过的菌、毒种以及有菌的各种器皿，必须先经高压灭菌后才能洗涤。用过的玻片上的活菌、吸管等用具上的活菌应先浸泡于500010000mg/L有效氯的含氯消毒液中（充分淹没，排除气泡）3060min（或其它有效的消毒剂中处理）后进行清洗。芽孢污染者应延长浸泡时间至120min以上。（八）在进行高压蒸汽灭菌时，必须严格遵守操作规程，注意观察压力、温度变化和维持时间，灭菌进行的全过程中负责消毒者不准离开消毒室。（九）须进行培养的试验材料和物品必须标明名称、编号、组别、姓名及处理方法，置于老师指定的位置进行培养。（十）必须爱护国家财产、厉行节约、严禁浪费；注意节约使用水、电
10、、药品及试剂；易损物品要小心轻放，精密仪器更要特别爱护和细心使用和维护。不慎损坏了仪器设备应及时向指导老师报告，执行报损登记或按规定进行赔偿。（十一）每次实验结果，应以科学的态度，求实的精神认真按记录填写、分析和整理实验报告，及时交指导老师评阅。（十二）实验完毕，应将仪器放回原处，将实验台面收拾整齐，并作消毒处理。离开实验室前应注意按要求脱去衣、帽、口罩等并认真洗手消毒，关好门、窗、灯、火、电源、煤气等，然后离开细菌检验中的注意事项（一）培养基制备时应注意，培养基不应有沉淀，若有则应过滤；制备后的培养基必须及时灭菌以避免细菌繁殖；培养基的装量应不超过容器的1/3，最多不得超过2/3，以免溢出；
11、制好的培养基应存于冷暗处，但不得放置过久，在锥形瓶中者最多不得超过1月，以免水分丢失和染菌；已溶化的培养基应一次用完，开启后不宜再用或反复加热溶化，溶化时不应在电炉上直接加热，以免营养成分破坏，最好以微波炉溶化。（二）在供试品检验的全过程中，必须符合无菌操作要求 。使用灭菌用具时注意不可接触可能污染的任何物品，灭菌吸管不能用口吹吸。（三）在无菌室操作使用酒精灯时，切勿在火焰正上方操作，以免将供试品内细菌杀死。（四）在生物安全工作台上操作时，应避免双手来回出入工作台，在无菌室操作时也应避免操作者来回出入无菌室。（五）不溶于水的供试品必须助溶后再用于试验，以免造成试验误差。供试品稀释时，应注意每一
12、稀释度换一支吸管，且原吸管不得吹洗，以免造成误差。（六）在使用灭菌吸管时，管尖不要接触可能污染的任何容器、用具或物品（瓶口、试管口等）。（七）在用接种针或环接种供试物于平皿或试管时，挑取样本前和接种后均须按要求灼烧，灼烧的长度应足够，并应防止爆溅。接种及划线动作要准确，接种针或环的未灭菌的杆或柄不得触及试管和平皿。（八）在进行血清学试验时，应先进行预试，以了解诊断血清的效价或是否出现典型的凝集模式。在制片时应注意不能让样本溅溢或污染其它物品，用后的玻片等应置消毒液中浸泡消毒或高压灭菌处理后方可清洗或丢弃。（九）在进行10倍递增稀释时，吸管插入稀释液内不得低于2.5，反复冲洗约10次；吸液高于吸
13、管上部刻度少许，然后提起吸管贴于容器内壁取1ml；靠近液面（但勿接触液面），缓慢地吹出全部供试液至第二个容器中（注意，第一级稀释液所用吸管切勿接触第二级稀释液），将吸管放入盛消毒液的容器内。（十）经验证明，两极稀释和两个平板多不能如实反映染菌量，误差较大；应采用三三制，即稀释三级，每一稀释度用三个平行平板。（十一）取供试液加注于平皿时，供试液须充分混匀，若取上清液或沉淀必然影响结果。但应注意混匀时液体溅溢形成气溶胶。（十二）在将培养基倾注于平皿时，培养基应在溶解后冷至451使用，高于45易造成细菌受损或死亡，低于者易凝固，影响混匀，使用前用水浴保温较好。倾注好琼脂与样品混匀时动作既要轻快又要防
14、止溅溢到平皿盖边或盖上，以免影响结果。（十三）从供试品稀释、加注平皿、倾注培养基的整个操作过程应在1h内完成，以免时间过长而导致细菌繁殖或死亡。（十四）凡供试品品种不同，按规定应分别作阳性对照试验，同一品种不同厂家和批号均应做阳性对照。阳性菌对照未生长者，检验无效。（十五）若进行无菌检验时，其培养期应在规定的时间内观察（一般7d），必须逐日观察，了解培养过程中的变化，不可在培养期结束时才观察结果；若有疑问时，须延长培养时间；对供试品引起培养基混浊者，若无菌生长，应在培养7 d后，取原混浊培养物转种，再培养23d并染色、镜检证明有无菌生长；若供试品含有抑菌物质或因灭菌不彻底等情况可在5d、7d以
15、后生长。实验室质量控制1.仪器设备 用于检验的仪器应定期校准2. 培养基 试剂的质量 使用标准菌株对培养基进行质控3.消毒灭菌效果 采用生物法或化学法监控灭菌效果4.加强记录和核查 建立良好的实验记录、核查制度5.报告质量 对于检样应分层次报告，初步报告和确诊报告。第二章一、临床标本的采集与处理 一般原则1早期采集： 2无菌采集： 3根据目的菌的特性用不同的方法采集： 4采集适量标本：5安全采集：标本的处理： 环境敏感细菌保温并立即送检；其他标本应2h内送检一)血及骨髓样本的采集1采样时间 发病早期、急性期或症状典型时 2采样部位及频率 增加采样的频率和改变由一个部位为多个部位采样，可以提高培养的阳性率 3样本采集的量: 血培养的阳性率与血样本的量直接相关。一般成人血量为每瓶10ml，婴儿为12ml，儿童为35ml 4样本的送检: 立即送到细菌实验室，若不能立即送检时，应将已接种的培养瓶置于温室，切勿置冰箱存放 5注意事项: 无菌操作, 同时需氧和厌氧培养 二)尿液样本的采集1采样时间 一般应采集晨起第一次尿液送检；原则上应在使用抗菌药物前采样。2采样
