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1、微生物学实验讲义绪论 实验课的目的与要求1、普通微生物学实验的目的掌握微生物的基本操作技能，了解微生物学的基本知识；加深对课堂理论的理解。同时培养同学认真观察思索、分析解决问题的能力和严肃认真的科学态度。2、普通微生物学实验课的要求a、实验预习 了解实验的目的和原理，做到每一步实验都心中有数。b、实验观察和记录 微生物实验的连续性较强，实验中也较常出现突发情况，所以要求同学认真细致观察，如实记录。c、实验结果 要求同学实事求是地填写实验结果，交给老师评阅。d、爱护公共财物并维护公共秩序：公用的仪器药品用后放回原处。对精密仪器（显微镜、天平）细心维护，轻拿轻放。从冰箱或温箱取放物品时要随时关门。
2、对消耗性的材料、用品、药品要厉行节约（擦镜纸、滤纸条等）。3、实验室规则微生物实验不同于动、植物实验，我们会经常接触到一些致病菌或条件致病菌，所以希望大家严格遵守无菌操作，为保证自身及他人的健康，以防污染或感染。a、实验室的整洁 非必需书、物品请勿带入实验室，不得在室内吸烟、进食，实验后收拾、擦净桌子。b、实验时的需小心 如遇到盛菌试管打破或皮肤破伤要及时处理。c、实验培养的材料 标明自己的组别、处理方式，放入教师指定地点培养。d、实验后的灭菌 所用物品可进行3%来苏水浸泡消毒或高压灭菌。e、实验前后 工作之前先洗手，工作后用肥皂洗手。f、离开实验室 一定关闭、水、电、门、窗。第一部分 微生物
3、的染色与形态结构的观察基本原理：虽然可以用相差显微镜等直接观察微生物的形态特征，但其应用有局限性；用电子显微镜可以观察到微生物的各种形态结构，但因其价格昂贵、设备条件要求高、操作也较复杂，应用上也受一定限制。所以，一般实验室仍常用普通光学显微镜来进行微生物形态学特征的观察。然而，微生物（尤其是细菌）细胞小而透明，当把细菌悬浮于水滴内，用光学显微镜观察时，由于菌体和背景没有显著的明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以，用普通光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及其某些细胞结构。因此，为了研究微生物的形态特征和鉴别不同类群
4、的微生物，微生物的染色及形态结构的观察是微生物学实验中十分重要的基本技术。用于微生物染色的染料，是一类苯环上带有发色基团和助色基因的有机化合物。发色基团赋予化合物的颜色特征，助色基团则赋予化合物能成盐的性质，仅含发色基团的苯化合物（称色原）即使带有颜色也不能作为染料，因为它不能电离，不能与酸或碱形成盐，对微生物（或其他材料）没有结合力，很容易被洗脱或机械方法除去。染料通常都是盐，分酸性染料与碱性燃料。在微生物染色中碱性染料较为常用，如美兰（亚甲兰）、结晶紫、碱性复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属碱性染料。这部分实验着重于细菌的染色观察，同时也进行放线菌、酵母菌和丝状真菌的形态学观察。其目的是使
5、同学在掌握细菌染色观察技术的基础上，了解其它微生物形态结构的观察方法；初步认识各类微生物的形态特征，巩固课堂知识，增强感性认识。实验一 细菌形态与运动性观察实验目的：1、掌握悬滴法、压片法观察细菌运动的技术2、学会显微镜下辨别细菌的运动性和非运动性3、通过压片染色，观察细菌的形状实验原理：1、悬滴法是普通光镜观察细菌运动的常用方法。过程大致如下：用接种环取适量污水滴在盖玻片上将盖玻片翻转置于凹玻片上封闭好后，减弱光圈，观察污水中细菌的形态及运动。压片法（即水浸片法）:取适当量的污水滴于载玻片上用干净盖片从一端轻轻放下，将水滴压开（注意防止气泡产生）置显微镜下观察。2、镜下观察时，活菌往往都在不
6、断运动，但有些运动是细菌本身的运动而另一些是由于水分子运动而引起的布朗运动。如何区分呢？细菌的运动如鱼在水里游泳，各有一定前进方向，且可以改变运动方向；后者只是由于液体流动而引起的细菌在原来位置上稍有变化的摇摆颤动。3、细菌的个体微小常常为无色透明，往往需要给其染色、增加色差，以利于观察。另外不同细菌的菌体各部分对某些染料的着色性不一，因此染色还可以区分不同的菌种并识别菌体的各部分。染色时应注意：载片干净，无油腻（要求碱洗，酒精泡）涂拌的菌体切勿太多 加热固定或染色切忌过度或不足实验物品、器材（提示同学检查自己的实验用品）显微镜 擦镜纸 香柏油 凹玻片 盖玻片 载玻片 凡士林（或浆糊）滤纸条
7、玻璃蜡笔 接种环或接种针 污水 做好动球杆菌的成片 盛废物品的平皿实验过程1、悬滴法2、水浸片法（1、2参见实验指导）3、压片染色法：在前述水浸片法的基础上，观察到细菌的形态后，取下载片，用吸管滴一滴0.1%美兰于盖片边缘，对侧用滤纸条轻吸，染色观察。实验要求与结果1、观察各种类型菌的运动，注意区分真正运动和布朗氏运动。观察各种菌的形态特点，并绘出球菌、杆菌和螺旋菌的形态。实验小结：1、教师提前做好，课上演示2、结束之前，检查及摆放桌上的东西。3、显微镜的擦拭、维护。4、灯的使用及显微镜的各部分结构要讲解。实验二 细菌的简单染色法实验目的1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法
8、。2、初步认识细菌的形态特征。3、巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。实验原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带负电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或
9、刚果红等酸性染料染色。实验器材1、菌种 枯草芽孢杆菌12-18h营养琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物。2、染色剂 吕氏碱性美蓝液（或草酸铵结晶紫染液），齐氏石炭酸复红染液。3、仪器或其他用具 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。实验步骤1、涂片 取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环挑取1-2环）生理盐水（或蒸馏水）于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液（或液体培养物）涂片，可用接种环挑取2-3环直接涂于载玻片上。*载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和
10、取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。2、干燥 室温自然干燥。3、固定 涂面朝上，快速通过火焰2-3次。*此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。热固定稳定不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。4、染色 将玻片上平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。吕氏碱性美蓝染色1-2min；石炭酸复红（或草酸铵结晶紫）染色约1min。5、水洗 倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。*水洗时，不要直接冲涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜急、过大，以免涂片薄膜脱落。6、干燥 自然干燥，或用电吹
11、风吹干，也可用吸水纸吸干。7、镜检 涂片干后镜检。*涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。实验报告1、根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。2、思考题你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？为什么要求完全干燥后才能用油镜观察？如果你的涂片未经热固定，将会出现问题？如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢？实验三 革兰氏染色法实验目的1、学习并初步掌握革兰氏染色法。2、了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。实验原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法的基
12、本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，象简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、
13、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结构的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。本实验将介绍被普遍采用的Hucker氏改良的革兰氏染色法。实验器材1、菌种 大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌约24h
14、营养琼脂斜面培养物，蜡样芽孢杆菌（B. cereus）1220h营养琼脂斜面培养物。2、染色剂 革兰氏染色液。3、仪器或其他用具 同实验五。实验步骤1、制片 取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。*要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。2、初染 滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2min，水洗。3、媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。4、脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。*革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是格兰氏染色操作的关键环
15、节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般约20-30s。5、复染 用番红染液复染约2min，水洗。6、镜检 干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色是革兰氏性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。7、混合涂片染色 按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌或大肠杆菌和金黄色葡萄菌作为混合涂片、染色、镜检进行比较。实验报告1、结果 列表简述3株细菌的染色观察结果（说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应）。2、思考题（1）你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？最关键的环节是什么？（2）现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行特制片染色，以证明你的染色结构正确性。（3）你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。（4）进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？（5）革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？（6）你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？实验四 细菌的芽孢染色法 一、目的要求1
