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1、 内科主治医师辅导：幽门螺杆菌工程疫苗研究进展1.抗原基因的选择讨论疫苗的首要任务 便是查找免疫原，Lazowskaetal在HP蛋白免疫原的查找方面作了较为精彩的工作，最初应用全菌抗原和膜佐剂口服免疫Hp感染的小鼠，胜利诱导小鼠爱护性免疫反响，但全菌抗原成分简单，副反响多，研制Hp亚单位疫苗成为必定。HpUre基因组，由A，B，C，D四个亚基基因组成，基因构造已清晰，其中A，C，D亚基免疫原性差，其免疫爱护作用非常微弱，仅有UreB亚基能产生爱护性免疫，是疫苗和诊断用抗原的主要候选基因之一；CagA基因较大，编码分子量94KD的细胞毒性相关蛋白，是Hp的主要致病因子。因此讨论UreB或Cag
2、A相关的疫苗将能有效预防致病Hp的感染和发病，Ure作为候选菌苗有很多优点：在菌株中含量丰富，分布在细菌外表，广泛表达和高度保守；其大分子量和颗粒状构造也更有利于粘膜免疫接种。Pappoetal用纯化的HelicobacterfelisUreB亚单位和CT口服免疫小鼠后可抗Hf定植，而UreA亚单位则无爱护作用，UreB亚互单位和LT口服免疫小鼠，同样产生抗Hf感染爱护力，重组的Ure和LT口服、鼻腔、直肠免疫同样能够诱导小鼠产生免疫爱护力，Ure抗体被动免疫小鼠后也能预防Hf感染的事实，间接说明Ure诱导产生的免疫爱护力是体液免疫应答介导的，螺杆菌属的Ure同源性特别高，HpUreB亚单位和
3、佐剂CT口服免疫小鼠可抗Hf感染的事实，说明螺杆菌属的Ure存在穿插性表位，免疫后可引起穿插性爱护，目前在小鼠模型上已证明多种Hp抗原包括VacA，Ure，CagA，过氧化氢酶、HpGroES类蛋白等。都可诱导小鼠产生免疫爱护力。疫苗能否去除已有的感染？Doidge采纳Hp超声裂解物和重组UreB亚单位，结合CT口服免疫慢性Hp感染小鼠，结果证明口服免疫兼具预防和治疗双重作用，Doidge在Hm感染的雪貂中也发觉类似结果。Ghiaraetal讨论了Hp相关抗原作为疫苗治疗慢性Hp感染效果，同时也试验大肠杆菌突变脱毒肠毒素作为粘膜佐剂的可能性，结果说明不管是Hp超声裂解物或者重组蛋白VacA和C
4、agA，与UTK63一起免疫，都胜利地去除了小鼠体内已有的Hp，并且免疫3mo后仍无感染，Marchettietal试验了LT，LTK63佐剂与全菌、内源性VacA，Ure，CagA及重组VacA，CagA的免疫爱护作用，发觉都可激发小鼠产生免疫爱护。2.关于佐剂粘膜免疫 需要强的佐剂以提高抗原的免疫原性，粘膜佐剂可刺激Th2型粘膜免疫反响。将来的Hp疫苗必需辅以能有效诱导粘膜免疫的佐剂，活化Th2细胞免疫途径，才能产生大量的slgA，才能克制Hp抗原性弱的问题。CT和LT是目前讨论最为深入的粘膜免疫佐剂，它们都具有较强的粘膜免疫原性和粘膜佐剂效应， 与不相关可溶性蛋白抗原同时口服免疫机体，能
5、消退机体对这些免疫蛋白的耐受性，诱导机体产生针对CT及其免疫蛋白的长期免疫记忆。它们都能促进抗原递呈细胞的抗原呈递，选择性诱导抗原特异性Th2细胞应答，促进上皮内淋巴细胞的有丝分裂和B细胞种型分化，但由于CT口服时在某些品系小鼠诱生超敏反响，而改用CT-B单位即可避开，故有人认为CT-B是至今为止最为有效最为安全的粘膜免疫佐剂之一，目前人们更为亲睐LT-B，由于LT-B较CT-B拥有更牢靠的安全性和有效性，Michertietal在临床试验了重组HpUre和LT口服免疫Hp染的志愿者的安全性和免疫原性，结果发觉治疗患者仅消失腹泻等，较少的副反响；而使用脱毒LT可避开以上副反响。LTK63与LT
6、区分在于丝氨酸取代了第63位的赖氨酸，LTK63作为粘膜佐剂在动物模型上已胜利诱导抗原特异的体液免疫反响和风疹病毒特异的毒性淋巴细胞反响，因此LTK63作为佐剂完全可能在将来临床中用于Hp治疗性免疫。最近Kinetal采纳聚微囊包襄的全菌抗原口服免疫小鼠同样可诱导小鼠产生剧烈的系统和粘膜免疫，免疫8wk后，胃肠液中抗HPslgA和血清lgG仍维持较高平，Hp菌攻击小鼠爱护率高达95%，与CT，LT佐剂组比照无显着差异，说明聚微襄颗粒可以诱导针对Hp特异系统和粘膜免疫，并且可以作为将来Hp疫苗的佐剂。3.关于疫苗蛋白质分子的空间构造及抗原表位猜测 抗体分子在抗原上的结合位点称为抗原打算簇，又称抗
7、原表位。它是蛋白质的外表性质，常消失在分子的高暴露区域，其性质、数目及空间的构型打算其抗原特性，为准确描述抗原打算簇，可用同源蛋白质来评价特定氨基酸替换的影响以确定抗原表位的所在区，不过这里的表位是指“功能表位”，即一种蛋白质能在免疫检测中结合抗体的那一局部或片段、因此讨论某种蛋白质有意义的亚单位构造和功能，它在试验使用上有买际意义。利用计算机软件可以猜测蛋白质的空间构造和抗原位点，这可作为抗原多肽合成试验的选段参考，适当左右扩展成1020肽，也可用作抗原克隆表达试验前PCR引物设计时模板范围选择的参考，使扩增出的序列能够掩盖较多的猜测点，这对我们研制Hp基因工程疫苗有重要指导意义。4.Hp疫
8、菌的免疫爱护机制 免疫应答类型确实定直接打算人类疫苗学讨论进展，Hp感染的免疫应答类型很难确定，这是由于自然感染Hp后，引起的免疫反响无爱护性；而感染Hp的啮齿类动物，采纳经典免疫学技术很难分析疫苗的治疗性免疫应答机制。最近有报道在Hp感染者胃粘膜中slgA水平明显高于对比组，提示粘膜slgA在抗Hp感染中具有重要作用，Doigeetal用Hf超声裂解物免疫小鼠，发觉抗螺杆菌slgA水平与爱护作用亲密相关。T淋巴细胞在Hp感染中的爱护作用目前知之甚少。Hp感染患者外周血单核细胞的刺激和抑制作用已有报道，Hp感染的小鼠和人类，THI细胞被抑制，小鼠的爱护性免疫与THI细胞抑制和TH2细胞活化亲密
9、相关。目前Hp疫苗诱导机体产生爱护性免疫和治疗作用的机制仍不清晰，Ghiaraetal认为疫苗可能转变胃内Thl型应答反响，转变为THO或Th2型爱护性反响；并且在慢性Hp感染小鼠模型中出TH1细胞反响口服Hp菌苗诱导THO或Th2细胞活化反响，去除体内感染的细菌，Hp感染的小鼠模型讨论发觉Th2反响刺激程度与胃粘膜内细菌削减和胃炎消退亲密相关，Hp免疫小鼠体内发觉IFN-下清Thl反响，胃内Th2细胞分泌IL-4水平增高；体外培育Hp免疫小鼠后，发觉大量脾细胞中有Hp特异Th2细胞，脾细胞接种其他动物发觉明显削减胃内Hp感染量。Mohammadietal也发觉相像结果，并证明IL-4基因敲除
10、小鼠体内Hp感染数量明显高于对比组，目前讨论说明Hp慢性感染人群Thl细胞反响占主要地位，人类胃粘膜反响是否与小鼠一样？假如类似，采纳无毒粘膜佐剂，治疗性疫苗可能是去除Hp感染的新的方法。5.Hp感染的动物模型 研制Hp疫苗的先决条件是必需建立适宜、稳定的Hp慢性感染动物模型，以分析免疫应答和免疫爱护机制。在螺杆菌属细菌中，Hf与Hp的生化特征和生物学行为最为接近，其16sDNA基因序列与Hp的同源性高达94.6%，Ure、过氧化物酶、过氧化氢酶均为阳性，生长条件相近，还具有相对较广的宿主范围，Hf在小鼠胃内的定植无明显部位特异性，与人Hp胃内定植部位根本全都，并能引起与人类Hp相关胃炎相像的
11、病理转变。王继德博士etal讨论证明无特别病原菌级Balb/c小鼠对Hf易感，25只小鼠的感染胜利率为100%，并能在胃内长期存活达16wk以上，用ELISA法在感染16wk以后的小鼠血清、胃肠液中可检出抗Hf-lgG抗体，并发觉该抗体与Hp抗原有明显的穿插反响，这证明两种细菌有很多共同免疫原，Hp定植胜利的有悉生猪、狗和无胸腺小鼠。但这些动物昂贵，需特别饲养条件，且允许观看时间缺乏1mo，国内学者陈晶晶1990年最道了Hp的wistar大鼠模型的胜利复制，但缺乏之处在于Hp定植时间不超过1mo.有报道用灵长类动物复制Hp模型，由于灵长类动物胃内生理构造与人类高度相像，可望获得长期感染，但该纯
12、系动物不易获得，饲养困难，价格昂贵。另外由于Hp的动物宿主谱较窄，其动物感染模型尤其是常规小动物长期感染模型的建立，向未兄有胜利的报道。故人们在讨论中广泛应Hp的近缘菌感染小动物模型，Hf小鼠模型是最常用的一种。6.Hp减毒沙门疫苗 沙门菌是寄生于人和动物肠道的革兰阴性菌，它可以作为其他病毒、细菌、寄生虫等病原体的蛋白、抗原或表位的表达载体，向机体输送单价或多价抗原，诱发系统免疫和粘膜免疫，沙门菌通过其自然感染方式经过粘膜侵入呼吸道、消化道、雌性生殖道等粘膜淋巴组织，M细胞取和运输抗原。触发粘膜免疫反响，剌激slgA特异的B细胞向其他粘膜组织迁移并分化成浆细胞，分泌slgA释放到粘膜外表，防止
13、病原体再度感染。此外沙门菌也可随血流分布到机体的肝、脾和淋巴结等处，借居在单核巨噬细胞中，激发机体的免疫应答，减毒沙门活菌疫苗表达的外源蛋白，无论采纳口服免疫、鼻腔免疫、直肠免疫或阴道免疫，都能诱导哺乳动物产生显着而特异的免疫应答，包括全身和粘膜的体液免疫应答。目前沙门菌载体菌苗系统常见的突变株包括：Ty21a，aro，asd，cya，crp等突变株，其中aro基因突变株不仅高度减毒，而且具有良好的免疫原性，被广泛用作表达多种异源抗原的载体，而cya，crp突变株不仅减毒具有免疫原性，而且是双基因突变，回复突变的可能性微小，因此用该突变株作为载体菌苗很安全。目前减毒沙门菌疫苗讨论多利用其自然宿
14、主-小鼠来讨论外源蛋白的免疫源性，人类应用减毒沙门菌疫苗也取得了令人鼓舞的成果，目前Hp减毒沙门菌苗载体多为沙门菌突变株，如aro、phoPc等。Gomez-Durateetal用表达HpUreA，B亚单位的减毒沙门菌SL3261aro突变株，口服免疫Balbc，C57/B6小鼠，然后用野生株攻击，免疫组获100%爱护，对比组则无爱护作用，血清、胃粘液中抗Ure抗体均上升，说明减毒沙门菌能表达强免疫源性UrE.Corthesyetal用表达Ure的phoPc突变株鼻腔免疫小鼠也获得了满足的爱护率，能诱导体液吏疫和细胞免疫，并刺激T细胞增殖、分泌IFN，IL-2.IL-4，IL-5，IL-6等细
15、胞因子，说明沙门菌表达的Ure特异诱导了Thl，Th2等淋巴细胞反响。但是Hp减毒活疫苗的讨论尚有很多困难待克制：宿主对Hp减毒沙门菌苗的免疫应答机制及Hp菌躲避甚至破坏机体的免疫应答机制尚不清晰；需进一步提高减毒沙门活菌疫苗的安全性和免疫原性；研制稳定、高效表达Hp精制亚单位抗原的减毒沙门活菌疫苗。Hp感染与溃疡和胃癌的相关性己广为承受，耐药苗株不断增多以及进展中国家Hp感染率不断增高的事实，使我们只有寄盼望于疫苗来根治和预防Hp感染。国外Hp疫苗的讨论已临床前期试验。因此我们研制价廉、高效，兼具预防和治疗作用的疫苗已迫在眉睫。Hp菌体抗原成分简单，含有多种外毒素致病因子，全菌粗制抗原易于引发不良反响，Hp又难以大规模生产性培育；另外Hp减毒活疫苗的讨论有很多问题待解决，目前正重点进展组分疫苗及基因工程疫菌的讨论，因此查找和筛选的致病新基因是其疫苗讨论工作的重点，由于任何一种Hp成分作抗原其免疫原性都较弱，因此联合佐剂的亚单位疫苗能克制全菌疫苗的诸多缺乏；尤其是与佐剂一体化的亚单位基因工程疫苗的讨论，是Hp疫苗讨论的主攻方向之一。
