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1、烟酰胺干预UVB诱导豚鼠皮肤色素沉着的作用【摘要】 目的 探讨烟酰胺对中波紫外线致豚鼠皮肤色素沉着的抑制作用。方法 以亚红斑剂量UVB照射豚鼠背部10天建立皮肤无急性损伤色素沉着动物模型后，外涂基质和%、5%、10%的烟酰胺4周，在此期间观察肤色改变和测定皮肤L值。涂药结束后取材，进行MassonFontana、冰冻切片Dopa染色和黑素细胞超微结构观察，观察黑素细胞数量、形态和功能的改变。结果 涂抹5%烟酰胺4周后，豚鼠皮肤变白，L值显着下降，多巴阳性黑素细胞数及黑素含量指数较对照组明显减少。结论 5烟酰胺对UVB诱导的色素沉着有明显的抑制，它主要是通过抑制黑素细胞的增殖和黑素细胞内黑素小体
2、的合成而发挥作用。 【关键词】 烟酰胺；色素沉着； 黑素细胞 【Abstract】 Objective To investigate the inhibitory effect of nicotinamide on hyperpigmentation induced by UVB. Methods After hyperpigmentation was induced by UVB radiation on the back of brown guinea pigs， substance， %，5% and 10% nicotinamide were applied on the expose
3、d skin for 4 weeks respectively. During this process， the changes of skin coloration were observed with naked eyes and L value were measured. Then the biopsy specimens were taken from the treated skin， sections were prepared for special staining and TEM examination and the number of melanocytes and
4、melanin content index(MCI) were determined. Results After the application of 5% nicotinamide for 4 weeks， lightening effect was obviously observed with naked eyes and the L value decreased significantly. Compared with the substance control， the number of Dopa positive melanocytes and melanin content
5、 index were all significantly reduced () in the treated skin with 5% nicotinamide. Conclusion 5% nicotinamide is effective in lightening the UVB-induced pigmentation of guinea pig skin. This effect may be related to the declined proliferation of melanocytes and the inhibition of melanin synthesis in
6、 melanocytes. 【Key words】 nicotinamide；pigmentation；melanocyte 烟酰胺是近年来尝试用于美白和防晒化妆品中的一种化学物质1，2， 但对其效果和作用机制了解甚少。在国内，我们曾应用原代培养的人皮黑素细胞，探讨了烟酰胺抑制黑素合成的适宜浓度3，为进一步明确烟酰胺对皮肤色素沉着的抑制作用，本文以棕黄色豚鼠无急性损伤UVB致黑模型评价烟酰胺对皮肤色度的影响，并探讨了可能的作用机制。 1 材料与方法 实验动物 体重(35512)g，健康成年雌性Hartley棕黄色豚鼠10只。 受试物 carpobol基质；将烟酰胺溶于carpobol中分别配成
7、、5、10三种浓度。 动物模型 在豚鼠背部选定4cm4cm区域脱毛后用TL12Rs型 UV-B灯管按照/d剂量照射10天，辐照总量为165mJ。照射结束后将产生豚鼠背部皮肤分为4个相离区域，分别外涂carpobol基质、5、10烟酰胺，每日2次，共计4周。每周用Lab色度仪测定动物受试皮肤区域L值，涂药结束后，以Powershot S45数码相机摄影，然后在涂药部位取皮肤做组织学检查。 肉眼观察 实验期间，每日观察豚鼠皮肤的不良反应，如红斑、鳞屑和色素沉着。 染色方法 MassonFontana染色：按常规方法固定、脱水包埋、脱蜡后，入氢氧化银氨溶液作用1218h后分别经氯化金水溶液、5硫代硫
8、酸钠液处理数分钟。结果：黑素颗粒呈黑色。冰冻切片Dopa染色：新鲜组织低温恒冷切片于多巴染液中37孵育2h，水洗并浅染苏木素、曙红液。结果：活性黑素细胞呈棕黑色。 组织学观察 多巴阳性细胞计数 在高倍显微镜下，以单盲法计数Dopa切片中每平方毫米表皮基底层所含活性黑素细胞数。 黑素含量指数 使用IMS细胞图像分析系统。选择MassonFontana切片10处表皮，测定黑素颗粒面积占该处表皮总面积的百分比均值。 电镜观察 在电子显微镜下，观察黑素细胞超微结构变化。 统计学方法 采用SPSS 统计软件包处理数据，结果用表示。用单因素方差分析，组间两两比较采用Student-Newman-Keuls
9、法。 2 结果 皮肤外观观察 豚鼠背部皮肤在按/d低剂量UVB重复照射10天期间，未见皮肤潮红、红斑或皮屑等皮肤急性损伤反应，照射1417天色素沉着达到高峰。涂抹受试物后，豚鼠皮肤均未出现刺激反应。实验结束时，各组皮肤均有不同程度的色素淡化，而5浓度组皮肤色素淡化最明显见图1。图1 用药前后，豚鼠皮肤照片A：用药前；B：用药4周a基质对照；b 25烟酰胺；c 50烟酰胺；d 100烟酰胺 皮肤色度L值改变 Lab仪测定的色度L值是皮肤黑度的量化指标，L值越高说明皮肤越白。皮肤L值变化随时间改变，见图2。用药2周时，涂抹基质的皮肤由于UVB的滞后致黑作用L值下降了，而5烟酰胺组皮肤L值无明显降低
10、，两组具有统计学差异；用药4周结束时，基质皮肤L值下降了，而相应的5烟酰胺组皮肤较用药前L值上升了，10%烟酰胺组皮肤L值则上升了。图2 烟酰胺对UVB致黑豚鼠皮肤L值改变的影响 光镜观察 见表1。多巴阳性细胞计数和黑素含量指数的结果表明：与基质组比较，5和10烟酰胺可以减少表皮基底层黑素细胞数，同时可抑制黑素含量。但与5和10烟酰胺对黑素细胞和黑素合成的抑制作用差异无显着性。表1 烟酰胺对豚鼠皮肤黑素细胞和黑素含量的影响注：与基质对照组相比， *P 电镜观察 见图3。基质组皮肤黑素细胞细胞膜完整，胞浆内充斥大量成熟、期黑素小体和少量、期黑素小体，但细胞器较少；%烟酰胺组，黑素小体数量略微减少
11、；在5%烟酰胺组皮肤中，粗面内质网、线粒体等细胞器丰富，、期黑素小体明显减少，散在分布于胞浆中；10%烟酰胺组黑素小体分布与5%烟酰胺组近似。A 基质对照MC(X8400)B 25烟酰胺MC(X8400)C 50烟酰胺MC(X8400)D 10烟酰胺MC(X8400)图3 烟酰胺对黑素细胞超微结构的影响 3 讨论 烟酰胺与烟酸统称为维生素，是辅酶、的重要组成部分，在生物氧化过程中起递氢作用，促进生物氧化和组织新陈代谢4。研究表明烟酰胺具有抗炎活性，能促进紫外线等诱导的DNA损伤修复，抑制UVB辐射的光致癌性，在临床上早已被广泛用于糙皮病、持久性隆起红斑、痤疮等皮肤病5。近年烟酰胺的延缓皮肤衰老
12、和美白功能也开始受到重视，国外已有在防晒剂中加入烟酰胺来达到防晒效果1。 烟酰胺是在光线、空气中性质最稳定的水溶性维生素，而且对皮肤刺激最小5。毒理实验发现其小鼠经口LD50为g/kg，大大超过临床使用剂量，而“三致”实验均为阴性，现已被美国FDA认作安全药物4。Franz做烟酰胺经皮吸收研究发现其平均弥散百分数为114。以上优点说明烟酰胺外用有减少色素沉着可能，关键在于烟酰 胺是否有减轻色素沉着的效果。 由于棕黄色豚鼠体内黑素细胞、黑素小体在毛囊、表皮的分布类似于人体中的分布，其致黑模型应用最为广泛3，6。不过，现有的紫外线诱导色素沉着的动物模型在建模过程中，多以大于最小红斑剂量的UVB在短
13、期内连续照射，皮肤红斑、蜕皮等皮肤损伤难以避免3，6。人体的自然晒黑过程通常不伴肉眼可见的皮肤损伤，因此为更好地模拟人体致黑情况，本文采用小剂量多次重复UVB照射致黑动物模型，在照射过程中，豚鼠皮肤无潮红、红斑、脱屑等急性损伤。 用药期间，涂抹基质的皮肤于用药1周时，L值降至最低，皮肤黑度达到最高峰，随后L值逐渐回升，其余三个烟酰胺浓度组的L值变化也呈现相似的趋势。用药2周时，5烟酰胺已开始抑制皮肤的色素沉着；用药4周实验结束时，涂抹5烟酰胺与10烟酰胺皮肤L值已经大于用药前L值，美白效果十分明显，只是这2个有效浓度引起的皮肤L值改变差异无显着性。肉眼观察和通过图像分析法对MassonFont
14、ana染色切片黑素含量的测定分析结果与用药后皮肤L值改变情况相符，从不同角度说明了烟酰胺具有较为肯定的美白效果。 皮肤色素沉着程度主要决定于以下几个因素：酪氨酸酶、多巴色素互变酶、二羟基吲哚羧酸氧化酶(TRP-1)等活化调节黑素细胞内黑素合成；黑素细胞增殖；黑素小体向角质形成细胞的转运和降解；角质形成细胞的新陈代谢速度等。通常，美白剂都是通过影响上述一个或多个因素发挥作用。 目前，学术界对于烟酰胺是否能抑制黑素细胞增殖存在争议：日本学者T. HAKOZAKI等1认为烟酰胺对黑素细胞增殖没有影响；帕它木等7以不同浓度烟酰胺处理人皮黑素细胞发现随烟酰胺浓度增加、作用时间的延长，抑制黑素细胞的增殖作
15、用明显增强。但现有的关于烟酰胺美白机制的探讨都局限在细胞水平，离体细胞毕竟不能反映人体的全部特征，从细胞外推到人体，需要一个很重要的步骤动物实验。本次动物实验对涂抹烟酰胺的皮肤组织活检Dopa染色的结果显示5和10烟酰胺均可明显减少位于表皮基底层的、具有黑素合成功能的活性黑素细胞数。由于在紫外线辐射下，角质形成细胞分泌的细胞因子对于黑素细胞的功能状态影响较大，如Imokawa等8研究发现紫外辐射诱导表皮中IL-1增多，IL-1可以促进角质形成细胞中内皮素的释放，而内皮素反过来又可促进黑素细胞的分裂增殖，所以，即使离体细胞结果与本次动物实验结果有差异，考虑是由于角质形成细胞和黑素细胞间的相互作用引起的。 此外，有研究表明烟酰胺在体外和活体都可以抑制活性氧族的形成9，也有研究表明由紫外线辐射诱导产生的ROS10，并促进表皮黑素细胞的黑素合成11，因此烟酰胺也可能通过抑制黑素细胞内的黑素合成发挥作用。于是，本文在透射电镜下观察用药4周皮肤组织超微结构的改变，结果表明与基质组皮肤相比，外用5烟酰胺的皮肤表皮黑素细胞中、期黑素小体明显减少。因此考虑抑制黑素细胞也是烟酰胺的作用途径之一。 总之，外
