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1、细胞生物学实验设计杂交瘤细胞冻存时间长短对其复苏后成活率的影响2010级生命基地班*201000140*摘要杂交瘤细胞通常是由小鼠骨髓瘤细胞与脾脏细胞融合产生的。杂交瘤细胞分泌产生的 单克隆抗体具有诸多优点，这也使得其在医学上应用广泛。产生单克隆抗体的融合细胞可 以在液氮中冻存，达到随取随用的效果，但融合细胞的冻存时间长短可能会对复苏后细胞 的成活率有很大的影响。本实验旨在测定不同冻存时间杂交瘤细胞复苏后的成活率，从而 保证在杂交瘤细胞复苏成活率较高的时间期限内将细胞及时的取用，防止杂交瘤细胞由于 冻存时间太长而失效。关键词杂交瘤细胞、单克隆抗体、抗体筛选、原代培养、传代培养、冻存时间、复苏、
2、成活 率、细胞计数实验目的1. 熟悉细胞融合的步骤以及产生单克隆抗体骨髓瘤细胞的筛选2. 掌握对骨髓瘤细胞进行原代及传代培养的方法；3. 熟悉细胞冻存与复苏的实验操作；4. 熟练掌握细胞成活率测定的方法。实验原理A. 杂交瘤细胞的制备杂交瘤技术即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。它是在体细胞融合技术基 础上发展起来的。Kohler和Milstein证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成 能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体 单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技 术。这一技术的基础是细胞融合技术。骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末 细胞，不能在体外繁殖。如将小鼠的骨髓瘤细胞
3、与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合， 则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的 能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交 瘤。杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞 分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞( B 淋巴细胞)的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则 可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有 B 细 胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能
4、和 保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。动物体内的 B 淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下，可以大量增殖变成浆细胞以分泌针 对于该抗原的抗体。脾内不同的 B 淋巴细胞克隆可分泌针对不同抗原的抗体。当受到特定 外来抗原刺激时，相应的 B 淋巴细胞克隆便大量增殖以分泌相应的特异性抗体。动物免疫 的作用就是用特定外为抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激能分泌针对于该抗原抗体 的B淋巴细胞大量增殖，从而得到大量产生专一的B淋巴细胞。B 淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但它在体外存活很短时间 (最多两周)后 即死亡；而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白，却能在体外长期存活。如果能将这两种细 胞的特性结合起来
5、，我们就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。脾脏是动物体内B淋巴细胞集中的最大免疫器官，取出脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤 细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞, 自身融合的脾细胞和 骨髓瘤细胞，以及脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。其中杂交瘤才是我们需要 的，因此就要设法将此杂交瘤细胞从上述细胞混合液中挑选出来。B. 杂交瘤细胞的筛选在细胞融合后，要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞，一般使用 HAT 培养进行筛 选，HAT养基中含有次黄嘌吟(H)、氨基喋吟(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。细胞的DNA合成 有内源性途径(主要途径)和外源性途径(旁路途径)两种方
6、式。内源性途径就是利用谷氨酰 胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而外源性途径则是利用次黄嘌 吟或胸腺嘧啶在次嘌吟鸟嘌吟磷酸核糖转移酶 (Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase, HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下来补救合成DNA, HAT 培养基中氯基喋吟是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能有效地阻断 DNA 合成的内源性途 径。 B 淋巴细胞具有 HGPRTTK 这两种酶, 因此在内源性途径被阻断后仍能利用 HAT 培养基 中的次黄嘌吟和胸腺嘧啶来合成DNA，可在HAT培养基中存活，
7、但B淋巴细胞是正常细胞, 故不能长期存活。杂交瘤技术中所使用和SP2/0-Agl4骨髓瘤细胞为HGPRT-的TK-缺陷型， 缺乏HGPRT酶和TK酶在内源性途径被阻断后不能进行DNA的外源性合成，故不能在HAT培 养基中存活。杂交瘤细胞由于继承了 B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成 HGPRT酶和TK酶，故在HAT养基中能长期存活。因此将融合后的混合细胞在HAT培养基中 培养两周后，只有杂交瘤细胞能存活下来，成为制造单克隆抗体的细胞源。C. 细胞的原代培养与传代培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生 理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维
8、持其结构和功能的一种培养技术。动物 细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶 消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称 为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时， 用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2 或其他比例转移到另一个容器 中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内 的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要 方便和简
9、单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的 活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种 疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类 健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手 段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单 因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个 领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应
10、用。细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离； 观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。D. 细胞的冻存与复苏为了保持培养细胞的生物学特性和活力，防止其发生遗传性质的改变，减少工作量和 物资的消耗，在细胞传代培养时需进行细胞冻存和复苏。细胞低温冻存的机制目前尚不十分清楚。细胞冻存时，如不加保护剂，其内部的水将 直接形成冰晶，造成细胞内部膜结构的破坏，使其很难成活。应在冻存液中加入保护剂二 甲亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）再进行细胞的冻存，保护剂可使冰点降低，在缓慢 的冻结条件下，使细胞内的水分在冻结前析出细胞外，
11、并降低电解质浓度，使低温下增加 的电解质浓度所造成的损害减少到细胞能够耐受的程度。低温对细胞的损伤取决于降温和复温的速度和条件。为了保持细胞最大的成活率，一 般采用慢冻快融的方法。缓慢降温可使细胞外液先冻结出现冰晶，细胞发生脱水，细胞内 不出现冰晶。在细胞从0C降温到-25C这一阶段，冷冻的速度在（-1-2C/min ）为 宜。当温度降至-25C，降温速度可增至（-5-10C/min ），到-100C可迅速浸入液氮 中。细胞的化学和物理活性在-130C以下最小，所以要长期保存培养的细胞，目前最广泛 应用的冷冻剂是液氮。液氮的沸点是-196C，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，对细胞 的 pH 值
12、没有影响，气化时不残留沉淀。 冻存的细胞在复苏时必须尽快融化，使之迅速通 过细胞最易受损伤的-50C,以防止冰晶的损伤。E. 细胞的成活率测定细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。活细胞和死亡细胞在生理 技能和性质上主要存在一下差异： 细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作 用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展 出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染 料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应 用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的
13、生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性， 死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。 代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能 力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧 光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提 高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释 放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下 显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光 素，荧
14、光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚 甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能 使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无 色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝 仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。细胞具体数目的测定使用血球计数板。血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上 有 4 条槽而构成 3 个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边 上面各有一个方格网（如图 1）。每个方格网共分 9 大格，其中间的一大格（又称为计数室）
15、 常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16 个中方格，而每个中 方格又分成 25 个小方格；另一种是一个大方格分成 25 个中方格，而每个中方格又分成 16 个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由 400 个小方格组成（图 2）。每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为lmm2，每个小方格的面积为1 / 400mm2,盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室（大方 格）的体积为0.1mm3,每个小方格的体积为l / 4000mm3。使用血球计数板直接计数时，先 要测定每个小方格（或中方格）中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生 物细胞的数量。图1血球计数板的构造（a、平面图；b、侧面图）
