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1、基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一种碱基换成此外一种碱基。二、定点突变的原理通过设计引物,并运用CR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩余来的就是我们的CR产物，在PC产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化，筛选阳性克隆,再测序拟定就行了。三、引物设计原则引物设计的一般原则不再反复。突变引物设计的特殊原则:(1）一般引物长度为2545 ，我们建议引物长度为3035 b。一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12p。若两边引物太短了，很也许会导致突变实验失败,由于引物至少要1-1个b才干与模板搭上,而这种突变PR规定两边都能与引物搭上，因此两边最佳各设
2、至少2个b，并且合成多一条反向互补的引物。 (2)如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值,看与否达到78(C含量应不小于4%)。 （3）如果值低于8,则合适变化引物的长度以使其Tm值达到78(GC含量应不小于4)。 (4）设计上下游引物时保证突变点在引物的中央位置。 (5)最佳使用通过纯化的引物。T值计算公式:m=041（% GC)/L+1. 注:L:引物碱基数;o C：引物GC含量。四、引物设计实例以GCCG为例：-CTTAATGAGGCGACTACTTATTGGG-3（）一方面设计0b长的上下游引物,并将A(T)设计在引物的中央位置。rimer #1: -CCTTCAG
3、ATTGAGACTACATC3 Primr #2: GAATAAAAGTCTCTACAACTAAG-（)引物GC含量为40%,为0，将这两个数值带入m值计算公式,得到其T=5.(Tm=014-7/30+81.)。通过计算可以看出其Tm低于78,这样的引物是不合适的，因此必须调节引物长度。(）重新调节引物长度。Primr#1:5-CCTCTAGTATGTACGACTTACTTAGCG- Prmer 2: 5-CCCAATAAGTAAGCGTCTCATAAAGAGG在引物两端加5mer(斜体下划线处），这样引物的GC含量为.7%，L值为3,将这两个数值带入值计算公式,得到其Tm为8095(Tm=.
4、414.5675/35+81.5)，这样的引物就可以用于突变实验了。五、突变所用聚合酶及Bffr引物和质粒都准备好后,固然就是做C喽，但是对于PC的酶和bue，不能用平时的,我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几种K，因此要用那些G bffer或扩增长片段的bffer，此外,要用保真性能较好的PFU酶来扩增,避免引进新的突变。除了使用基因定点突变试剂盒，如Statagen和塞百盛的试剂盒，但价格昂贵。可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌迅速aq酶、akaa的PmSTARTM HS polmase。六、如何去掉P产物最简朴的措施就是用Dp酶，nI可以辨认甲基化位点并将其酶切，我们用的模
5、板一般都是双链超螺旋质粒,从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株),而PCR产物都是没有甲基化的，因此Dp酶可以特异性地切割模板(质粒)而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下C产物，因此提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。DpI解决的时间最佳长一点,至少一种小时吧，最佳能有两三个小时，由于如果模板解决得不干净，哪怕只有那么一点点,模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。七、如何拿到质粒直接把通过pn解决的PC产物拿去做转化就行了,然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒,拿去测序，验证突变成果。八、图示九、定点突变操作环节A 诱导突变基因（PCR反映）以待
6、突变的质粒为模板，用设计的引物及uta-rect酶进行PCR扩增反映,诱导目的基因突变。1. 设计点突变引物。 注参照引物设计指引2准备模板质粒DN A注用dam+型菌株(例如H5菌株)作为宿主菌。在end+型菌株中常有克隆数低的现象,但是对突变效率没有影响。提取质粒DNA时我们建议您使用我司的质粒提纯试剂盒。3. 选项对照反映体系(反映体系)1Recionuer5lUC cntrol pasi（10g/l,ot 20ng)2lCotrol primr mi（2poll）ldP iure(each .5)2ldH2O lMtadiec Enz1l4.样品反映体系(5l反映体系）1eaci uf
7、fr5lSample lasmid（10ngl,totl 0ng）2lSaple pre（F)（0p/l）1lSale prim (R)(10pmol/)ldNTP mxture(each 2.5mM）2lH38lMutadirectEzyme. PC反映条件注按如下参数设立PCR扩增条件。CycesTemeatre Rcio Timcyce95 30secce3051n 21mi plasmid Kb6. PCR扩增反映完毕后冰育5分钟,然后置于室温(避免反复冻融）。注 按下列提供的PCR条件进行扩增，控制PC循环数。注意当突变点位点超过4个时会发生突变率减少的现象。MuationCyce
8、12cleide1cyles3Nucleoties8cycles 突变质粒选择PCR反映结束后使用Mutazyme酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DA。1. 准备PCR反映产物2. 加入1l(0U/l)Mtazyme酶37温育1小时。注当质粒DN用量过多时uazyme酶也许发生与样品反映不完全的现象。因此我们建议为了保证突变率请严格遵循实验环节进行操作。如果突变率低，可以合适延长反映时间或增长Muayme酶用量。C转化反映完毕后在质粒D上会产生缺口，当把这个质粒D转入E.coi中时请选择am+型菌株，例如DH5。.将1l样品加到50感受态细胞里,然后放置在冰上30分钟。 接下来可以参照一般的转化环节进行。序列分析一般当B平板上出白色菌落则表白发生了突变。 为了证明这一成果，我们建议对白色单菌落进行测序分析。
