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1、第四章细胞培养技术制药 第一节 动物细胞制药 一、动物细胞制药的基本原理 动物细胞制药首先涉及到的就是细胞体外培养的一些基本原理和基本操作，这些和普通的细胞体外培养技术基本一致 表达过程中能以正确的方式进行折叠和修饰大多数能以天然形式分泌到培养基中，从而确保了生产的蛋白质具有天然产物抑制的活性、免疫原性和体内寿命一些人用和兽用的重要药物蛋白，尤其是相对较大、复杂或糖基化的蛋白质来讲，动物细胞培养制药是首选的生产方式，如病毒疫苗、干扰素等 1. 用于蛋白药物生产的细胞系 CHO（中华仓鼠卵细胞），MRC-5人淋巴母细胞，重组NS0，BHK，鼠杂交瘤细胞，SP2/0，FRh12，BIRMA-1细胞
2、系，LB2细胞，ES-15&ES4细胞系，MS20 2. 细胞的凋亡 在 10 升以上的发酵罐中培养密度超过每毫升百万个细胞技术还不成熟为了获得最大的产量，人们把注意力一直放在生物反应器的设计和培养基的优化设计上最近，细胞凋亡在限制培养性能方面的影响才开始列入考虑范围 一般地讲，经受程序死亡的细胞都接受到了一个死亡刺激信号信号转变成对细胞的程序性破坏1）细胞凋亡引发的途径 至少有两条途径引发细胞凋亡受体介导途径胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase线粒体介导途径 释放凋亡酶激活因子激活caspase2）细胞凋亡的诱因 细胞培养中，除了程序性凋亡外，细胞凋亡还和培养的环境有关 外界因素营养成分
3、的耗竭，会引起细胞的衰老和凋亡 培养中产生的活性氧，可能导致细胞凋亡培养液中的渗透压提高与细胞凋亡的增加呈正相关，但是增加二氧化碳的分压，并不增加细胞的凋亡 丁酸能够促进哺乳动物某些启动子（如CMV和SV40）控制的基因表达，但是它也能抑制细胞生长，诱导细胞凋亡 剪切力是生物反应器环境中另一个导致细胞死亡的潜在原因，高强度的剪切力会导致坏死性细胞死亡，但较低强度剪切力的影响还不清楚由于代谢压力而引起的细胞内环境的改变也会诱导细胞调亡，如在低pH的环境下，半胱氨酸蛋白酶（caspases）的激活过程更快细胞间信号传递在源于培养的细胞凋亡中起重要作用，如细胞会释放自分泌因子，以响应密度、营养水品或
4、受体介导的毒性代谢物的存在，一些能降低细胞间联系的生长因子抑制剂，如阿拉明可阻止细胞凋亡3. 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 1）表达用载体 ：启动子，增强子，选择标记，mRNA剪切位点和多聚核苷酸序列，多克隆位点和复制必需成分 2）DNA导入动物细胞常用的技术 ：外源DNA导入到哺乳动物细胞的过程称转染 ，脂质体转染技术，电穿孔技术，基因枪，DEAE-葡聚糖方法，磷酸钙沉淀法3）DNA在细胞内的表达 瞬时表达是指外源DNA导入细胞内后，不经过选择培养，外源DNA在细胞增殖过程中逐渐丢失，目的蛋白的表达也是短暂的。该培养方法简捷，周期短永久表达是指外源DNA导入细胞内后，经过选择培养，外源DN
5、A稳定地存在于细胞中，目的蛋白的表达持久恒定二、转基因动物细胞生产的药物 干扰素1a，治疗回归热性硬结病人临床恶化，CHO细胞生产，2002年上市 重组糖蛋白，Tenecteplase，可减低急性心肌梗塞死亡率，CHO，2000年上市 重组糖蛋白，抗血友病因子，CHO，2000年上市 内源糖蛋白，干扰素n1，治疗慢性丙肝，人淋巴母细胞，1999年上市 重组血友病VIIa因子，治疗A型和B型血友病，BHK,1999年上市 IgG1和TNF受体融合，治疗风湿性关节炎，CHO，1999年上市 重组血凝因子IX，控制B型血友病病人的出血，CHO，1997年上市 第二节 转基因动物制药首个转基因动物生产
6、药物 Atryn2009年2月6日首次批准了用转基因山羊奶研制而成的抗血栓药物Atryn上市山羊奶中产生抗凝血酶，用于治疗遗传性抗凝血酶缺乏症马萨诸塞州的GTC生物制药公司研发生产一、产生重组蛋白的动物组织系统 ：血液，尿液，精液，蛋清，蚕茧，乳汁二、转基因动物操作的原理和方法 1. 重组载体的构建 ：编码区启动子增强子调控元件筛选标记2. 转基因技术 ：直接核DNA显微注射逆转录病毒载体感染胚胎囊胚内注射遗传改变的胚胎干细胞精子作为基因转移的载体3. 胚胎分割和核移植技术 胚胎分割就是在动物胚胎早期，每个细胞有全能性的时候，将各个细胞分离开，重新发育成胚胎，而且可以将胚胎能冻保藏，可以将有优
7、良性能的胚胎保持下去 核移植就是将胚胎的细胞核或体细胞的细胞核，移植到去核的受精卵或卵细胞中，以获得优良遗传性能的动物 第三节 植物细胞制药一、研究概况 植物细胞培养现在已经是一门专门的学科1902年，Haberlandt细胞全息论的理论开始，植物大量培养技术生产植物精细化学产品是发展十分迅速的领域植物正成为外源基因重要的表达体系可进行翻译后加工和糖基化、不含潜在的人类病原、成本低 目前应用最多的是药用植物细胞的大规模培养，解决原料和保护环境红豆杉，治疗乳腺癌和晚期卵巢癌效果较好5,20-环氧-1,2,4,7,10,13-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-
8、(2R,3S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯树皮中有万分之二左右的含量，每提取1公斤紫杉醇就要活剥10吨树皮每提取公斤紫杉醇约需要5万公斤红豆杉干枝叶1995年野生红豆杉被列为国家一级保护植物每克可以制成33克针剂，每支含紫杉醇大约30毫克每支进口制剂1500元/支（“泰素”），国产800元支（“紫素”）二、药用植物大规模培养 3个基本步骤：第一步是诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织和悬浮细胞系第二步是筛选高产细胞系第三步是生物反应器中大量培养细胞或细胞团 植物快繁技术三、植物转基因技术 将外源基因导入植物细胞的过程叫做细胞的转化农杆菌转化法基因枪转化法花粉管通道转化法 第五章 抗体工程制药 抗
9、体药物的生产传统的方法抗血清淋巴细胞的培养如何获得需要的淋巴细胞？如何体外培养淋巴细胞？第一节 抗体药物概念及其特点 一、抗体药物概念 通过细胞工程或基因工程生产的，用于诊断或治疗的单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、基因工程改造的抗体或免疫偶联物统称为抗体药物 免疫偶联物生物导弹是免疫导向药物的形象称呼由单克隆抗体与药物、酶、毒素或放射性同位素等配合而成二、抗体药物特点 1. 特异性 1）与相关抗原的特异性结合2）对靶细胞的选择性2. 多样性 1）抗原多样性 2）结构多样性 3）抗体活性的多样性 4）免疫偶联物和融合蛋白的多样性第二节 杂交瘤技术与单克隆抗体 1975年，德国学者Kohler和
10、英国学者Milstein合作研究将经绵羊红细胞免疫后的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，建立了能持续分泌抗棉样细胞抗体的杂交瘤细胞，从而创立了具有划时代意义的新技术，为此获得了1984年医学诺贝尔奖 一、抗体的种类1. 多克隆抗体多克隆抗体含有两层意思：一是有含多个抗原位区的大分子刺激产生的、识别不同抗原位区的各种抗体；二是由体内不同淋巴细胞产生的、可针对同一抗原位区的多克隆抗体 2. 单克隆抗体仅识别抗原分子上同一抗原位区的由同一克隆细胞产生的抗体为单克隆抗体 抗 原免 疫传统抗血清（所有抗体混合）脾 脏 淋巴結 B 細胞二、杂交瘤及杂交瘤技术 细胞杂交的含义包括同一细胞的自融合或是在诱导物的
11、作用下不同细胞间的融合淋巴细胞通过融合剂的作用和肿瘤细胞形成融合的杂交细胞称杂交瘤细胞通过肿瘤细胞和淋巴细胞的融合，用于某些细胞特性的研究和生产所期望的免疫分子，称为杂交瘤技术 目前杂交瘤技术在免疫学领域的应用有两种B淋巴细胞杂交瘤，即用骨髓瘤细胞和B淋巴细胞进行融合而制备抗体，也是引用最广泛的一种T细胞杂交瘤技术，肿瘤细胞和T细胞融合而制备具有免疫活性的淋巴因子 通常人们所述的杂交瘤技术即知B淋巴细胞杂交瘤，也可称为单克隆抗体技术三、单克隆抗体 单克隆抗体是由一个骨髓瘤细胞和一个具有分泌抗体能力的B淋巴细胞融合形成的杂交瘤细胞，通过无性繁殖形成的细胞系而获得的这个细胞系的每个细胞均具有相同的
12、特性且高度均一，这一细胞系分泌的抗体均一性极高，活性、亚基、亲合力均相同单克隆抗体的特点 抗体结构高度均一。抗体分子在结构上高度均一，甚至在氨基酸的序列和空间结构上都相同 高度特异性。抗体识别的是抗原分子上单一的抗原位区稳定的生产特性。产生抗体的细胞是可以无性繁殖的细胞系第三节 杂交瘤细胞系的建立一、免疫B淋巴细胞的制备 1. 抗原凡是能具有抗原性质的物质均可制备单克隆抗体，抗原可以是全病毒、亚单位或纯化分子，也可以是蛋白质、多糖、脂类等 用于制备单克隆抗体的抗原在理论上讲，纯度要求就可以不高，也可以使混合抗原 2. 免疫 动物的选择：目前常用的骨髓瘤细胞系来自BALB/c小鼠和Lou大鼠免疫
13、方法：A. 体内免疫法B. 脾内免疫法C. 体外免疫法二、 骨髓瘤细胞的选择 在B淋巴细胞杂交瘤技术中，主要是用多发性骨髓瘤细胞作为亲本细胞，这种细胞是来自骨髓造血细胞的一种肿瘤，分泌单一抗体的浆细胞，并且衰变成不表达自身抗体或部分表达常见的骨髓瘤亲本细胞系有Sp2/0，NS-1，Y3，YB2 三、 免疫脾细胞的制备 经免疫的BABL/c小鼠或Lou大鼠，摘眼球、断颈等方法处死后，无菌摘取脾脏，研磨制取B淋巴细胞悬液，经氯化铵破碎红细胞后，洗涤并调整到（15）X107个ml浓度备用 四、 细胞融合 将免疫脾B淋巴细胞和骨髓瘤细胞按照（510）：1混合后离心取上清，缓慢加入分子量在4000600
14、0的50PEG 1ml，间隔1分钟后，缓慢加入无血清培养基，终止融合剂的作用，经洗涤去除融合剂后加入细胞培养液，分种于96孔板中 五、特异杂交瘤细胞的选择 1. 杂交瘤细胞的选择 融合后，有杂交瘤细胞有骨髓瘤B淋巴细胞、B淋巴瘤细胞B淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞，还有未融合的骨髓瘤细胞和B淋巴细胞一般用HAT培养液进行筛选 2. 特异性抗体的筛选 筛选出的杂交瘤细胞并不是都能分泌所期望的抗体，所以还要对杂交瘤细胞做的二次筛选，即对所分泌的抗体进行检测 一般地，细胞培养的上清液中，抗体可以达到每毫升微克级的水平，目前检测方法的灵敏度都可以达到。实验室常用的是酶联免疫的方法，即ELISA方法 以酵素免疫分析法检测样本中的专一性抗原六、杂交瘤细胞的克隆和建株 1. 杂交瘤细胞的克隆化 2. 杂交瘤细胞系建株 七、单克隆抗体的制备 1. 动物体内诱生法 2. 体外培养法 单株抗体的生产纯化八、单克隆抗体生产的一般流程 体外培养的骨髓瘤细胞 免疫纯系小鼠，取脾脏细胞 体外融合 HAT选择培养 抗体检测，阳性孔 克隆化培养，抗体检测 阳性克隆扩大培养 冻存细胞，建立细胞库 体外法制备单克隆抗体 体内法制备单克隆抗体腹水 抗体检测 单克隆抗体产生的流程第四节 基因
