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1、上 海 师 范 大 学实 验 报 告专业、年级 食品科学与工程 班级 1班 姓名 刘杰 学号 110153414 课程名称免疫学 实验名称硝基呋喃多克隆抗体的制备（可溶性抗原CPAHD-OVA)实验日期 实验目的动物性食品作为一大类食物，主要是指来源于猪、牛、羊、马、狗、兔、禽以及水产类动物的，可供人食用多的肉、乳、蛋及制品和副产品【1】。但动物性食品又较易腐败变质，从生产、加工、贮运到消费各个环节，很容易受到环境有毒有害物质污染。这些有毒有害物质除对畜禽造成直接危害外，其在动物体内积蓄和富集，通过食物链成为人类健康的潜在威胁【2-3】。众多动物性食品安全问题中，兽药及药物添加剂残留问题是影响
2、动物性食品安全的最主要因素之一。近年来水产品硝基呋喃类药物残留超标事件屡屡被发生，严重威胁人民身体健康和我国水产品的出口贸易。加强对硝基呋喃类药物残留检测和控制有着十分紧迫的现实意义。【4】基本原理 免疫动物是通过给待免疫的动物注射抗原，使其获得相应的抗体的过程。抗原给予的方法不仅对免疫应答的起始有较大影响，而且决定着对新注射抗原的免疫吞噬和吞噬后加工处理的细胞类型，并影响对其发生免疫应答的外周淋巴器官。材料(一)动物：健康雄性家兔2只(二)器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、
3、黑丝线、塑料放血管等。(三)试剂1.灭菌生理盐水；2.纯化人IgG(10mgml)；3.消毒酒精及碘酒；4.弗氏不完全佐剂（FCA）5.弗氏完全佐剂（FIA）6.弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：吸2ml FCA于研钵中，逐滴加入1mgml纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。7. 弗氏不完全佐剂乳化抗原(FIA-IgG)的制备：吸2ml FIA于研钵中，逐滴加入1mgml纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。免疫方法 1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分毛，以酒精及碘酒消毒皮肤
4、；2.第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(人IgG)下称FCA-IgG)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。3.第二次免疫：间隔14天后，于两侧腘窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FIA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧腘窝及鼠蹊部皮下。4.间隔10天后，从耳静脉采血0.51.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。效价至少应达到116以上时才能放血。5.若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液(人IgG)耳静脉内注射免疫。即于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、
5、0.5ml。间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。另外,也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐剂(FIA)乳化的抗原(人IgG)(简称FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、剂量和间隔均同第2次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。首次注射后一周或稍长时间再次进行加强注射，可大大增强免疫应答。对免疫原性弱的抗原，需要多次注射 (注射5-6次)，可以在适当的时间间隔内，有效的控制抗体效价的增加。放血颈动脉放血家兔麻醉后仰卧于兔架上固定头部及嘴部，用绳子固定四肢，头部略低以暴露颈部。剃毛并消毒皮肤。沿颈部中线用手术刀切开皮肤约10cm，分离皮下结蹄组织，直至暴露气管两侧的胸锁乳突肌。用止血
6、钳分离胸锁乳突肌和气管间的颈三角区疏松结蹄组织，暴露出颈总动脉，钝化分离神经和结蹄组织。于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端丝线，近心端的动脉用血管夹夹住。用尖头眼科手术剪从两根丝线间的动脉上剪开，近心端插入50ml离心管。此时松开血管夹，使血液流入容器中。【5】放血过程中要严格按无菌要求进行。 分离血清将三角烧瓶的血置37温箱1小时，再置4冰箱内34小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(0.01硫柳汞或0.02叠氮钠，最终浓度)，分装后置4冰箱中保存备用。结果鉴定效价的测定酶联免疫吸附ELISA技术在微孔条上预包被
7、偶联抗原，样本中的残留经衍生化后和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗呋喃妥因代谢物的衍生物抗体。注意事项1.免疫用实验动物的抗体反应性个体差异性较大，因此免疫时至少应选用两只以上动物。另外，不能使用妊娠动物。2.硝基呋喃类代谢物分子量在70-150之间，远小于1000，属于小分子量物质，不能直接刺激动物集体产生免疫应答，所以需要与大分子物质如牛血清蛋白BSA，人血清蛋白等合成相应的免疫原，才能获得相应的特异性抗体。3.抗原的质量很关键，与BSA及KLH偶联的氨基酸位置也很重要，增强抗原的免疫抗原性不能破坏其本身的抗原表位。4.免疫用的抗原必须经FCA或FIA充分乳化后才能注射，否则将明显影响抗原的
8、免疫效果。5.佐剂一方面可提高特异性免疫反应的效果获得高效价的免疫血清，但若抗原不纯时，可使抗原中极微量的污染物(0.005mgN)产生抗体，以致导致免疫血清的纯度受到影响。另外，有些实验动物种系对BCG过敏，尤其是豚鼠，当再次注射完全佐剂时,可以引起变态反应而导致免疫失败。为此，第二次免疫注射时应减少佐剂中BCG的含量或改用不完全佐剂，以减少和防止变态反应的发生。6.抗原的剂量决定于抗原的种类。对免疫原性强的抗原剂量应相别较少，免疫原性弱的抗原剂量可相对较多。抗原的用量一般以体重计算。在使用佐剂的情况下，一次注入的总剂量以0.5mgkg体重为宜。如不加佐剂时剂量可加大10倍。另外，免疫周期长者可少量多次注射，免疫周期短者可较大量少次注射。
