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1、2 四环素的生产2.1 菌种2.1.1菌种选育抗生素工业经过半个多世纪的发展，已经成为医药工业中的一个重要 支柱。抗生素产量的提高和质量的改进，以及品种的增多无不包含着菌种 选育在其中的作用。菌种选育6、发酵和提取组成了抗生素工业生产的三个 主要环节，其中以菌种的影响最大。刚从自然界筛选出来的抗生素菌种的 产量都很低，因为在自然界为了防御和攻击其它微生物而进行生存竞争不 需要高的抗生素产生量。工业生产则不然。工业生产抗生素的目的就是要 制取高产量的抗生素，所以要将菌种不断地进行人工诱变，筛选高产菌， 以逐步提高菌种的抗生素生产能力。因此，择优选取，四环素一般选金色链霉菌为菌种培养。沙土管接种于
2、斜面，待斜面培养成熟后, 用无菌水制成孢子悬浮液， 再用经灭菌的玻璃珠将孢子打散, 即得单孢子悬浮液。2.1.2菌种保藏菌种保藏7是指在广泛收集实验室和生产菌种、菌株（包括病毒株甚至 动、植物细胞株和质粒等）的基础上，将它们妥善保藏，使之达到不死、 不衰、不污染以便于研究、交换和使用的目的。而狭义的菌种保藏的目的 是为了防止菌种退化、保持菌种生活能力和优良的生产性能，尽量减少、 推迟负变异、防止死亡，并确保不污染杂菌。有效的菌种保藏方法，是防 止菌种退化及其必要的措施。菌种保藏的具体方法很多，原理却大同小异 首先要挑选典型菌种的优良纯种，最好采用它们的休眠体（如分生孢子、芽孢等）；其次，还要创
3、造一个适合其长期休眠的环境条件，诸如干燥、 低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度调节剂等。其方法主 要有斜面保藏方法、液体石蜡油保藏法、干燥保藏法、冷冻干燥保藏法、 真空干燥法、液氮超低温保藏法和液相保藏法等。2.2 生产与发酵工艺2.2.1发酵的一般流程培养基配制种子扩大培养空气除菌发酵设备培养基灭菌发酵生产2.2.2 生产工艺流程8下游处理发酵液草酸酸化，过滤酸化滤液调节pH9，加氯化钙沉淀钙盐沉淀物四环素粗碱草酸酸化,脱色酸化液调节pH4.0四环素碱成品投入丁醇液中,加盐酸过滤升温结晶四环素盐酸盐2.2.3 发酵工艺要点1）孢子制备四环素种子采用麸皮孢子，麸皮质量有重要影响2）
4、氯剂金色链霉菌正常情况下产生多为金霉素。添加抑氯剂可使金霉素 7 位 氯元素不能接入，变成以产四环素为主。3）磷酸盐的影响高浓度磷酸盐压制戊糖循环和丙二酰单位的合成，发酵过程需要控制 磷酸盐浓度（4）其他因素3.2 工艺过程及技术要求3.2.1 发酵工艺流程砂土管划线或涂布接斜面斜面孢子30度培养7-8天，洗液接麸皮孢子营养基料 正丙醇34度培养40小时，接种子罐种子罐34度通气搅拌，培养30小时，按10-15%种量接发酵罐发酵罐32度通气搅拌，补料培养160-180小时，放罐发酵液3.2.2 工艺过程控制要点（1） 孢子制备及控制要点孢子培养一般采用淀粉、玉米浆等琼脂斜面培养基,37C,培养
5、710d, 即生长成熟。孢子培养基中的配比适当与斜面孢子的质量和菌种的发酵单位有重要 的关系；琼脂本身的质量对孢子质量和数量也有重要的影响，而这一点常 常为人们所忽视。为了减少因琼脂产地、加工方法不同而引起斜面质量的 差异，可用水洗琼脂，除去某些可溶性杂质，以提高和稳定孢子质量。光 对斜面孢子生长有抑制作用，应该避光培养。（2） 种子培养及控制要点 种子培养是采用淀粉、葡萄糖、黄豆饼粉、硫酸铵和碳酸钙等组成的 培养基。直接用红霉菌孢子悬液亦可用摇瓶种子培养液作种子罐接种。各 级种子于2835C进行培养，经一定时间后，种子生长成熟，即可移入发 酵罐。种子培养基的成分和质量对孢子发芽和种子质量都有
6、重要影响，种子 质量还与种子培养时消耗功率的大小有明显关系，在不损害菌丝的情况下 增加种子培养的输入功率，能使四环素的发酵单位直线上升。3.2.3 培养基的组成 四环素发酵培养基主要成分为液化淀粉，玉米浆，黄豆粉，每罐外加 二巯基苯并噻唑和NaBr, pH在6左右。各培养基成分比可见表1、2、3， 如下：表 1 斜面及平板分离培养基的百分配比数据种类麸皮琼脂磷酸氢二铵磷酸二氢钾硫酸镁配方3.02.00.050.020.03斜面及平板培养条件：培养温度33C，相对湿度45%-65%,培养4-5d。表 2 种子培养基的百分配比数据玉花蛋酵氯碳磷酸淀种米生硫酸硫酸白母化酸二氢粉油类淀饼镁铵胨粉钠钙钾
7、酶粉粉配4.02.00.50.60.030.030.40.40.030.5 0.1方种子培养条件：培养温度 31 T，相对湿度45%-65%,摇瓶装量30mL/250mL 三角瓶, 摇床转速 129r/min, 培养 28h。表 3 发酵培养基的百分配比数据种类玉米淀粉花酵氯化钠碳酸钙磷酸二氢钾玉米浆淀粉油酶玉蛋白胨米粉生饼粉母粉硫酸 硫酸镁铵配6.52.03.50.50.50.030.030.30.60.011.00.5 0.1方发酵培养条件9培养温度3C，相对湿度45% -65%,摇瓶装量30mL/250mL三角瓶，摇床转速129r/min，接种量25%,培养6d。 注：金色链霉菌正常情况
8、下产生多为金霉素。故添加适当抑氯剂可使金霉 素 7 位氯元素不能接入，变成以产四环素为主。3.2.4 培养基与设备、管道灭菌生产中其他菌种的存在，会使生物反应的基质或产物，因杂菌的消耗 而损失，造成生产能力的下降；杂菌也会产生代谢产物，这就使产物的提 取更加困难，造成得率降低，产品质量下降；有些杂菌会分解产物，使生 产失败；杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pH值，使反应异常；如果发生 噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，使生产失败。灭菌的方法很多，在实验室可以使用干热灭菌、对于环境可以使用化 学试剂灭菌，但化学试剂的灭菌方法有很大的限制。在工业生产中，对于 培养基、管道、设备的灭菌，通常采用蒸汽加热
9、到一定的温度，并保温一 段时间的灭菌方法，称之为湿热灭菌。湿热灭菌的显著优点是：使用方便 无污染，而且其冷凝水可以直接冷凝在培养基中，也可以通过管道排出。高压蒸汽灭菌法是微生物学研究和教学中应用最广、效果最好的湿热 灭菌方法。高压蒸汽灭菌是在密闭的高压蒸汽灭菌器（锅）中进行的。其原 理是：将待灭菌的物体放臵在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内。把锅内的 水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭。再继续加热就 会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100C以上。为达到良 好的灭菌效果，一般要求温度应达到121C（压力为0.1MPa），时间维持 15-30min。根据本生产，确定最终灭
10、菌温度为121C，时间为30min，由于 一次不能完全除尽，所以采取多次连续灭菌法，以确保完全灭菌，以免影 响最终生产结果。3.2.5 种子扩大培养从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产用种子，是一个有实验 室制备到车间生产的过程，其生产方法与条件随不同产品和菌种种类而异 因此，种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得 代谢旺盛、数量足够的种子，优良的种子可以缩短生产周期、稳定产量、 提高设备利用率。制备种子的过程大致可分为以下几个步骤： 将沙土孢子接种到斜面培养基中活化培养； 长好的斜面孢子或菌丝转种到扁瓶固体培养基或摇瓶液体培养基 中扩大培养，完成实验室种子制备； 扩大培养的菌丝接种到一级种子罐，制备生产用种子；如果需要， 可将一级种子再转种至二级种子罐进行扩大培养，完成生产车间种子制备 制备好的种子转至发酵罐进行发酵。四环素发酵采用的是三级发酵，将四环生产菌种的孢子悬浮液接入一级种子罐于27C培养40h,此时孢子发芽，长出短菌丝，故也称发芽罐。 再移至含有新鲜培养基的第二级种子罐，于27C培养1024h，菌丝迅速繁 殖，获粗壮菌体，故又称繁殖罐。此菌丝即可移到发酵罐作为种子，这称 为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。一般100m3发酵罐都采用三级发酵。
