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1、微生态制剂的免疫增效作用【摘要】 目的 制备针对禽流感病毒的非特异性免疫的活菌微生态制剂-禽温康，并探讨其对禽流感灭活疫苗的免疫增效作用。方法 精选优质中药金银花、板蓝根、黄芪、元参、当归、苍术等, 用活性乳酸菌进行发酵。发酵完成后，经过滤即可完成禽温康的生产。用禽温康进行疫苗免疫增效试验。结果 免疫增效试验表明, 在进行禽流感病毒灭活疫苗免疫的同时使用禽温康, 可在一定幅度内提高禽流感病毒抗体水平并能延长抗体维持时间。不同给药剂量比较试验表明, 兑水500斤疫苗增效作用兑水1000斤的。结论 禽温康对禽流感病毒灭活疫苗具有明显的增效作用, 且兑水500斤的疫苗免疫增效作用优于兑水1000斤的
2、。【关键词】 微生态、益生素、中药、发酵、禽温康; 禽流感; H 5N1; 特异性转移因子; 免疫增效。 禽流感( Av ian influenza, A I)是禽流行性感冒的简称, 又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟, 以区别于曾称之为亚洲鸡瘟的鸡新城疫。A I是由A型流感病毒中任何一型引起的禽类的传染性疾病综合征, 严重危害畜牧业发展和人类健康, 该病以引起禽类的呼吸系统及全身性败血症为特征。多年来在世界上许多国家和地区都发生过此病, 被国际兽疫局确定为A 类烈性传染病, 并被列入国际生物武器公约动物传染病名单。随着禽流感病毒的不断变异, 禽流感疫情也在不断地扩大和蔓延, 这些疫情不仅造成了严重的经济
3、损失, 同时也对人类健康构成了巨大的威胁, 导致人流感流行的机率和复杂性进一步加大。禽流感的控制对策是使用疫苗免疫并结合卫生与生物安全措施。目前我国农业部正式批准的疫苗有5种: 3种灭活疫苗, 2种活疫苗。灭活疫苗使用成本较高且易产生免疫应激反应, 有一定的副作用。而一些基因工程疫苗仅是采用了病毒的某一中和性抗原表位作为疫苗抗原, 因此接种家禽后引起的免疫保护作用并不完全。鉴于现行疫苗在免疫保护作用、免疫应激反应及免疫保护维持时间等多方面存在的问题, 研究能提高现行禽流感病毒疫苗免疫效率的增效佐剂具有极其重要的意义。禽温康的主要成分有以下几种：1、乳酸菌：改善肠道肠道大环境，通过乳酸菌在肠道的
4、大量繁殖，并伴随大量乳酸的产生，从而形成了肠道的酸环境，有效抑制有害菌群的繁殖和滋生；乳酸菌的免疫调节机能极受重視，和其菌体表面多糖成分有关。乳酸菌或其生产物质尤其菌体表面多糖，可调节免疫反应，最近发现肠细胞在接触到某些细菌菌体时，即会增加如interleukin 8,tumour necrosis factor 等蛋白质基因之表現，而这些物质已知能活化巨噬細胞，因而增进免疫反应。2、发酵中药提取物：精选中药具有清热祛火、清热解毒、燥湿止痢、健脾消食、扶正祛邪之功效，发酵中药比传统中药提高4-28倍，。3、生物抗菌肽：抗菌肽(Antim icrobial peptides,AM Ps)是生物机
5、体在抵御病原微生物的防御反应中所产生的一类抗微生物与一些恶性细胞的短肽。抗菌肽具有分子量小、水溶性好、耐热性强、无免疫原性、抗菌谱广等特点,极有可能成为一种高效、低毒并且无残留危害的抗菌、抗病毒、抗癌新药 。4、有机酸：有机酸是指一些具有酸性的有机化合物 ，有机酸除了具有抗生素作用外，还具有其它几种作用，包括降低消化物pH和增加胰腺分泌； 5、生物多糖：参与生物体的免疫调节，参与生命细胞的各种活动。降血糖、降血脂、抗炎症、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等，20世纪50年代发现真菌多糖具有抗癌作用，后来又发现地衣、花粉及许多植物均含有多糖类化合物，并进行分离提纯，确定了其化学结构、物理化学性质、药理作用
6、，尤其对多糖类化合物的抗肿瘤和免疫增强作用进行深入研究。 6、生物碱：正生物碱是一类植物次生物质。由于其分子中通常具有一个含氮杂环,环中的氮原子和氨基酸的氮原子一样,具有接受氢离子的能力,故具碱性。目前在4000多种植物中已分离出6000种左右的生物碱。最早分离和结晶出来的生物碱是吗啡碱,这是150多年前在罂粟中发现的。其它熟知的生物碱包括在烟草中存在的烟碱,金鸡纳树皮中存在的奎片,秋水仙中存在的秋水仙碱以及作为核酸、某些辅酶成分的嘌呤和嘧啶生物碱等。虽然生物碱是次生物质,但对医治人的疾病具有明显的疗效,还有许多在植物体内发挥着很重要的生理作用。 7、苷类：苷类是细菌蛋白合成的强力抑制剂,它能
7、使细菌核糖体分解。由于一系列氨基酸的异常排列和菌体表面蛋白的不可逆结合,可发生遗传密码错读现象。此外,苷类的杀菌作用与菌体细胞呼吸和胞浆膜通透性障碍以及DNA的稳定性破坏等有关。 本研究采用禽流感病毒H5N 1血清亚型灭活疫苗免疫鸡, 然后用禽温康饮水，, 探讨了其对禽流感病毒灭活疫苗的免疫增效作用, 旨在为研究和开发禽流感病毒疫苗的高效免疫佐剂提供部分可供参考的实验依据。1 材料与方法1. 1 疫苗及诊断抗原 禽流感病毒H5N1血清亚型灭活疫苗和禽流感病毒H5N 1血清亚型特异性血凝抑制(H I)抗原, 均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。1. 2 实验动物 实验组及对照组所采用的同品种1
8、日龄健康鸡均购自山东省临沂某种鸡场。1. 3 方法1. 3. 1 母源抗体监测 自实验鸡9日龄时开始监测禽流感病毒特异性抗体, 至其母源抗体为零或接近于零的水平用于以下实验。1. 3. 2 免疫 用禽流感病毒H5N1血清亚型灭活疫苗0. 25 m l肌肉注射免疫10日龄实验鸡, 同步设立对照组。于15日龄再以同批疫苗0. 3 m l肌肉注射作为加强免疫。1. 3. 3 抗体效价监测 按照实验设计每隔一定时间翅静脉采血分离血清, 依照中华人民共和国国家标准高致病性禽流感诊断技术程序进行血凝和血凝抑制试验, 监测疫苗免疫抗体效价。1. 3. 4 禽温康对H5N1血清亚型灭活疫苗的免疫增效试验 将实
9、验鸡分成3组: 对照组、兑水1000斤实验组和兑水500斤实验组。监测各组鸡群实验后19-73 d的抗体效价。第1组: 对照组。为仅用禽流感病毒灭活疫苗免疫组, 其免疫方法为10日龄时首免肌肉注射0. 25m l/羽,15日龄时加强免疫0.3m l/羽。第2组: 实验组，为禽温康兑水1000斤组。其方法免疫当天就开始使用禽温康进行饮水，每500ml兑水1000斤，连用5天。第3组: 实验组，为禽温康兑水500斤组组。其方法免疫当天就开始使用禽温康进行饮水，每500ml兑水1000斤，连用5天。分别于给予禽温康饮水后的19、33、48、61和73天检测各组实验鸡的抗体效价。2 结果2. 1 母源
10、抗体效价监测 H I实验结果表明, 本批实验鸡母源抗体于15日龄时趋于0, 至30日龄时消失至0, 结果见表1(空白对照组)。2. 2 疫苗免疫抗体监测 使用禽温康后不同日龄H I抗体监测结果见表1(禽温康组)。 表1 禽流感灭活疫苗H I抗体监测结果组别日龄9d15d30d36d40d51d禽温康组1.40.86.26.564.5空白对照组(母源抗体)1.40.500002.3 禽温康对H 5N1血清亚型灭活疫苗的免疫增效试验 第1组, 即疫苗免疫对照组至实验后73 dH I抗体效价降低2个滴度; 第2组, 即禽流感病毒特异性TF(注射) /禽流感病毒灭活疫苗免疫组至实验后73 dH I抗体
11、效价降低0.7个滴度; 第3组, 即禽流感病毒特异性TF(口服) /禽流感病毒灭活疫苗免疫组至实验后73 dH I抗体效价没有降低。结果如表2。 表2 免疫增效试验H I抗体监测结果组别天数(服用后)19d33d48d61d73d降低值500水禽温康组4.54.34.34.54.501000斤水禽温康组5.04.34.74.74.30.7对照组7.07.05.05.05.02.0 3 讨论 近年来, 禽流感在全球范围内越演越烈, 种种迹象表示, 新的流感大流行株极有可能再次来源于禽流感病毒。禽流感病毒作为人流感最大的基因库间接威胁着人类健康, 此外它作为一种新病原直接对人类构成威胁, 因此其公
12、共卫生意义不容忽视。禽流感病毒是一种变异十分迅速的病毒, 疫苗的研制速度远远赶不上病毒的变异速度, 因此疫苗和药物研制具有很大的局限性。造成有效免疫保护力产生时间较长、抗体滴度较低、有效免疫保护期较短、免疫保护作用不完全、易引发应激反应、应用成本高、缺乏针对性等问题。同时现有疫苗生产周期长、生产能力有限、部分还处于专利保护期内, 其他厂家无权生产, 必然导致药物供应不足。一旦暴发大流行, 疫苗和药物都难以满足需求。并且目前市场上缺乏用于人的禽流感疫苗, 一旦禽流感病毒发生重大变异或与人流感病毒发生重组在人类中大流行, 将是一个十分严峻的问题。有鉴于此, 寻找一种能改善现行禽流感病毒疫苗的免疫效
13、率的疫苗佐剂是十分重要的。转移因子是一种新发现的细胞因子类佐剂, 迄今为止, 国内外还尚未见有研制A IV 特异性TF并将其用于A I的预防和控制上的报道。我们的实验表明在进行禽流感病毒灭活疫苗免疫的同时使用禽流感病毒特异性转移因子对禽流感病毒灭活疫苗的免疫效果有显著增强作用, 能够在一定幅度内提高禽流感病毒抗体的水平, 延长抗体保持的时间, 为今后禽流感的控制和预防提供了可供参考的依据。不同给药途径比较实验结果表明转移因子口服途径给药对疫苗的免疫增效作用较注射途径给药效果更好, 这为转移因子在临床上应用提供了极大的方便。本研究采取淋巴细胞体外培养技术制备禽流感病毒特异性转移因子, 降低了成本, 国内这方面研究较少,转移因子具有无毒、无副作用、应用剂量小、作用迅速等优势, 这就避免了弱毒疫苗散毒、返强等问题。转移因子无种属特异性, 可超越种系界限, 这对于研究人用禽流感疫苗具有重要启示意义; 并且转移因子具有广泛的提高受体细胞免疫功能的作用, 因此即使是与受体的病毒型不同的特异性转移因子也可以发挥提高机体免疫力, 增强其抗病毒能力的作用。此外, 在进行禽流感病毒灭活疫苗免疫接种的同时, 还应注重搞好鸡群的饲养管理、环境卫生与消毒, 减少病原进入, 这样才能有效地防止禽流感的发生和蔓延。由于本实验未采用SPF鸡, 可能会对实验结果产生一定影响。
