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1、微生物限度检查方法验证方案六、验证内容1. 供试液的制备1.1. 取供试品10g,加PH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液至100ml,充分振摇使混匀，作为1:10的供试液.1.2. 取1:10供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液至100ml,充分振摇使混匀，作为1:100的供试液.1.3. 取1:100供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液至100ml,充分振摇使混匀，作为1:1000的供试液.备注：供试液制备假设需加温时,应均匀加热,且温度不超过45。命供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时.2. 菌液制备2.1. 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单
2、胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中,3035P培养1824小时；分别取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,依次稀释至、制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液.2.2. 接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中,2025P培养23天；取此培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,依次稀释至,制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液.2.3. 将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上,2025P培养57天,使大量的孢子成熟.加入3-5ml含0.05% (ml/ml聚山梨酯80的0
3、.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,将孢子洗脱.然后，采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%ml/ml聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液依次稀释至,制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液.2.4. 上述菌悬液制备后假设在室温下放置，应在2小时之内使用；假设保存在28。命可在24小时内使用.黑曲霉孢子悬液可保存在28。命在验证过的贮存有效期内使用.3. 计数方法的验证3.1. 需氧菌、霉菌与酵母菌计数平皿法所加菌液的体积不得超过供试液体积的1%.为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计
4、数方法适用性检查.3.1.1 .试验组取上述制备好的供试液,加入试验菌液、混匀，使每1ml供试液或每X滤膜过滤的供试液中含菌量不大于100cfu.一取的供试液9.9ml和小于10000cfu的铜绿假单胞菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml,混匀，凝固，于3035P倒置培养3天点计菌落数.平行制备2个平皿.一取的供试液9.9ml和小于10000cfu的金黄色葡萄球菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml,混匀，凝固，于3035P倒置培养3天点计菌落数.平行制备2个平皿.一取的供试液9.9ml和小于
5、10000cfu的枯草芽孢杆菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml,混匀，凝固，于3035P倒置培养3天点计菌落数.平行制备2个平皿.一取的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中,立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml,混匀，凝固，于3035P倒置培养3天点计菌落数.平行制备2个平皿.一取的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中,立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml,混匀，凝固，于3035P倒置培养3天点计菌落数.平行制备2个平皿.
6、一取的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中,立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基1520ml,混匀，凝固，于2025P倒置培养5天点计菌落数.平行制备2个平皿.一取的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中,立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基1520ml,混匀，凝固，于2025P倒置培养5天点计菌落数.平行制备2个平皿.3.1.2 .菌液组一取小于100cfu的铜绿假单胞菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml,注入平皿中,立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基
7、约1520ml,混匀，凝固，于3035P倒置培养3天点计菌落数.各平行制备2个平皿.一取小于100cfu的白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml,立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基各1520ml,混匀，凝固，于2025P倒置培养5天点计菌落数.各平行制备2个平皿.3.1.3.供试品对照组一取的供试液1ml,注入平皿中,分别立即倾注1520ml温度不超过45P胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，胰酪大豆胨琼脂培养基3035P倒置培养3天点计菌落数，沙氏葡萄糖琼脂培养基2025P倒置培养5天点计菌落数.各组平行制备2个平皿.3.1.4 .结果判断计算公式：稀释剂对照组菌数的回收率=稀
8、释剂对照组的平均菌落数一供试品对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数试验组菌数的回收率=试验组的平均菌落数一供试品对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数判定标准：实验组、稀释剂对照组如有的菌数回收率应在0.52之间.假设各试验菌的回收率均符合规定,照所用的供试液制备方法与计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数.试验结果供试品批号、.业TIM菌种类型试验次数菌液组实验组供试品对照组回收率铜绿假单胞菌1平均2平均3平均金黄色葡萄球菌1平均2平均3平均3 / 7枯草芽抱杆菌1平均2平均3平均白色念珠菌需氧菌验证1平均2平均3平均黑曲霉需氧菌验证1平均2平均3平均白色念珠菌霉菌、酵母菌
9、验证1平均2平均3平均黑曲霉霉菌、酵母菌验证1平均2平均3平均4 / 7结果判定：验证人：复核人：日期：日期：4. 控制菌检查4.1. 大肠埃希菌的验证4.1.1 .试验组取的供试液ml取相当于1g或1ml供试品的供试液，小于100cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml,加至约100ml的胰酪大豆胨液体培养基，于3035P培养1824小时.4.1.2 .阴性对照组取pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液10ml,加至约100ml的胰酪大豆胨液体培养基，于3035P培养1824小时.4.1.3 .阳性对照组取小于100cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml,加至约100ml的胰酪大豆胨液体培养基，于3035P培养1
10、824小时.4.1.4 .检查取上述培养物1ml,接种至含100ml麦康凯液体培养基内培养,4244P培养2448小时.取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上3035P培养1872小时.检查结果如下：第一次试验结果：供试品批号：序号步骤实验组阳性对照组阴性对照组1胰酪大豆胨液体培养基,3035培养1824小时2麦康凯液体培养基,4244C 2448小时3取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上,3035P培养1872小时假设麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化与适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；假设麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性,
11、判未检出大肠埃希菌.4分离纯化、染色镜检、生化试验等结果：第二次试验结果:供试品批号:序号步骤实验组阳性对照组阴性对照组1胰酪大豆胨液体培养基,3035培养1824小时2麦康凯液体培养基,4244C 2448小时3取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上,3035C培养1872小时假设麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化与适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；假设麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性,判未检出大肠埃希菌.4分离纯化、染色镜检、生化试验等结果：第三次试验结果:供试品批号:序号步骤实验组阳性对照组阴性对照组1胰酪大豆胨液体培养基,30
12、35培养1824小时2麦康凯液体培养基,4244C 2448小时3取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上,3035P培养1872小时假设麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化与适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；假设麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性,判未检出大肠埃希菌.6 / 74分离纯化、染色镜检、生化试验等结果：标准：阳性对照和试验组应检出大肠埃希菌，阴性对照应无菌生长.结果判定：验证人：复核人：日期：日期：备注：采用以上供试液制备方法，分别对需氧菌、霉菌与酵母菌计数和控制菌检查法进行方法验证时，假设结果不能达到各标准时，应继续采用其他方法如培养基稀释法、薄膜过滤法等消除供试品的抑菌活性,重新进行方法验证.七、验证异常情况处理本次验证实施人员异动情况：口发生变化口未发生变化，发生异动情况描述如下：本次验证测试仪器校验情况：口符合要求口不符合要求,不符合处理情况描述如下：本次验证实施异常情况：口有异常口无异常；异常处理情况：口已处理完成口未处理完成.实施小组组长：日期：审核人：日期：
