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1、链霉菌的分子育种策略摘要：现在链霉菌的选育已经进入分子育种阶段。其过程包括利用基因阻断、敲除、替换等突变技术了解基因的功能、表达、调控，进而进行抗生素的修饰、改造；将整个次生代谢产物合成基因簇转移到易于工业化操作的宿主系统中，引入抗性基因、调节基因和引入血红蛋白基因；利用基因筛选程序，筛选含有特定类型化合物的基因产生菌，进而获得了相应的次生代谢产物；利用基因组重排技术对出发菌株进行处理等。链霉菌接合转移体系研究的提出为分子育种打开了一个新的方向。系统改变基因结构可产生一个完整的突变株文库，从而构建大规模生产不同抗生素的工程菌。关键词：链霉菌，分子育种，基因 Method of Streptom
2、ycess molecular breedingAbstract:Now The breeding of Streptomyces has entered the stage of molecular breeding. The process includes: Using gene disruption, knockout, replacement mutation technology to understand gene function, expression, regulation and control and then have the, modification of ant
3、ibiotics. The secondary metabolite biosynthesis gene cluster is transferred to the easy industrial operation of the host system, introducing the resistance gene, gene regulation and introducing the hemoglobin gene;Use of genetic screening programs, screening of specific types of compounds containing
4、 the gene producing strain, and obtained the corresponding secondary metabolites;Use of genome shuffling on the starting strain processing and so on . the conjugative transfer system research of Streptomyces has opened a new direction for molecular breeding System changes in gene structure can produ
5、ce a complete mutant library, so as to construct the mass production of different antibiotic engineering bacteria.Key words: Streptomyces；molecular breeding,；DNA链霉菌是一类细胞壁类型为I型、革兰氏阳性、好气的最高等的放线菌。它是一种重要的资源微生物，具有广泛的物种多样性和代谢多样性，已知放线菌所产抗生素的90由本属产生。1但随着抗生素的高剂量大面积使用，抗生素的使用寿命也随之缩短，从而使得快速选育高产量、产新抗生素的链霉菌显得尤其重要
6、。随着基因工程技术和分子生物学手段的不断发展以及对微生物次生代谢机制的进一步了解，链霉菌的选育已由原来随机诱变筛选进入到分子育种阶段。分子育种，就是将基因工程应用于育种工作中，通过基因导入，从而培育出一定要求的新品种的育种方法。许多科研工作者将基因工程技术运用到了链霉菌育种之中，这包括：利用基因阻断、敲除、替换等突变技术了解基因的功能、表达、调控，进而进行抗生素的修饰、改造；将整个次生代谢产物合成基因簇转移到易于工业化操作的宿主系统中，引入抗性基因、调节基因和引入血红蛋白基因；采用各种基因操作技术，使不同化合物、不同来源的基因在同一菌株中重新组合，增加代谢产物的多样性2；利用基因筛选程序，筛选
7、含有特定类型化合物的基因产生菌，进而获得了相应的次生代谢产物3；利用基因组重排技术对出发菌株进行处理4，1 扩增表达次生代谢过程限速酶的基因抗生素在链霉菌体内的生物合成是由一系列酶催化产生的，在整个合成过程所用酶系中，限速酶的浓度大小是影响抗生素产量的重要因素5。深入了解限速酶基因，通过扩增该酶基因的拷贝数，可提高目的抗生素产量。1993年，Malmberg 等6对带小棒链霉菌（S.clavuligerus）生物合成头霉素和头孢霉素的过程进行研究， 结果发现-氨基乙二酸前体的产生是生物合成的限速步骤之一。他们从带小棒链霉菌中克隆了赖氨酸氨基转移酶LAT 编码基因，并使之在宿主染色体上多拷贝表达
8、，增加了LAT 酶数量，提高了头孢霉素的产量。2 敲除负调控基因敲除负调控基因，抑制无关代谢活动可增加细胞对目标产物合成在能量和碳源上的供应，从而提高目的抗生素的产量。2001 年，Paradkar 等7对带小棒链霉菌次生代谢产物进行研究发现，带小棒链霉菌同时合成2种结构上无关的次生代谢产物头孢霉素C 和克拉维酸，虽然这2 种次生代谢产物的生物合成具有完全独立的途径，但它们通过相互竞争初生代谢的能量和碳源来进行次生代谢的合成活动。通过敲除头孢霉素C 合成所必需的基因lat，可以完全停止头孢霉素C 的合成，而在lat 突变株中克拉维酸的产量提高了2-2.5倍。3 将整个次生代谢产物合成基因簇转移
9、至易于工业化操作的宿主系统天蓝色链霉菌是最早应用于次生代谢产物异源合成的宿主系统的模式菌。1993年，McDaniel等8通过基因敲除放线紫红素合成基因构建了工程表达宿主天蓝菌CH999，还成功构建了在该菌株中表达大片段的低拷贝穿梭质粒pRM5。pRM5携带了编码actact启动子激活蛋白的actact双向启动子序列act-ORF4 基因。4 改造抗性基因提高抗生素产量 一般来说，结构基因结构比较保守，难以进行有效改造。抗性基因是激活结构基因转录的必需成分，在对抗生素产生抗性的过程中具有较大的进化空间。在长期的进化中，链霉菌必须积累适当的抗生素耐药基因和相应的调节基因，以保护自身免受这些致命的
10、代谢物的破坏9。因此，改造抗性基因及其调控基因或提高这些基因的表达水平可以增强菌体对自身产生的抗生素的抗性，从而提高该抗生素的产量。 早在五十年代初，人们就发现抗生素的抗性水平与抗生素产量之间有一定的联系，并把提高抗性水平作为获得抗生素高产菌株的途径之一10。以后多年也不断有相关报导11。提高野生链霉菌菌株中的抗性基因拷贝数，不仅能够提高菌株的耐药水平，还能提高单位菌体的抗生素产量121984年，Thompson。和Davies提出抗生素生产限速因素之一是菌株对该抗生素的耐受力。两年后，Crameri和Davies据此通过扩增抗性基因提高了氨基糖普类抗生素产量13。他们将卡那霉素链霉菌(S.
11、myceticus ) M 1164的6一乙酞转移酶(抗性基因产物，氨基糖普修饰酶)基因克隆到高拷贝质粒载体pIJ702，转导到卡那霉素链霉菌ATCC 12853(卡那霉素产生菌)和弗氏链霉菌(S.fradiae ) ATCC10745(新霉素产生菌)中。结果表明包含有重组质粒的转化子均提高了对氨基糖普类抗生素的耐受性，并大大提高了卡那霉素和新霉素的产量。近年来，已有一些利用抗性基因的人工进化方式产生有益突变提高抗生素产量的成功例子，如引入链霉素抗性基因的突变可提高抗生素产量高达48倍14黄健强等15筛选获得含有丝裂霉素C抗性基因的612kb外源片段的克隆子。将含此外源片段的质粒pLX5导入变
12、铅青链霉菌(S. lividans)获得表达。并且首次成功地运用电穿孔法将pLX5导入野生型菌株中，使其对丝裂霉素C的抗性大幅度提高:最低抑制浓度(MIC)由原来的200 pg/ ml上升至1000 pg/ ml以上。涂国全等16通过采用链霉菌致死标记，获得了大量链霉素抗性基因(str)突变株，并进一步筛选到梅岭霉素高产菌株，梅岭霉素活性单位提高了77.9%。通过不同剂量EMS诱变分析抗药性突变率和:tr突变株产梅岭霉素产量，结果表明菌株抗药性突变与产量突变密切相关。5 引入血红蛋白基因链霉菌发酵过程中若能在链霉菌中导入血红蛋白基因，表达血红蛋白，就可使该细胞在贫氧状态下也能很好地生长。May
13、nolo 等将血红蛋白基因Vgb通过质粒pIJ699 转入变青链霉菌(S.lividans)和天蓝色链霉菌中获得了发酵需氧量明显降低的工程菌17。该工程菌的在限氧条件下，不仅菌体生长量增加，而且放线紫红素产量提高了10 倍。6 基因组改组基因组改组技术主要是指将传统育种得到的具有不同表型的菌株进行全基因重组,从而使得这些菌株的优良性状能集于一身。Zhang 等18在弗氏链霉菌的菌种改良研究中, 以自然筛选得到的野生菌株SF1 为出发菌株进行一轮NTG诱变以后, 将得到的11 个产量较SF1 有提高的突变株进行一轮基因组改组, 产生的新菌株产生泰乐菌素的产量就可以达到需20 轮传统诱变才能达到的
14、水平。Xu 等19 将原始链霉菌进行4 轮递归原生质体融合, 使原始霉素的产量提高了45.9%。乳酸杆菌对酸的耐受性一直是其发酵生产的限制因素, Patnaik等20以乳酸杆菌的野生型菌株为出发菌株, 用传统诱变手段分别得到对酸耐受性增加的pop1 和pop2菌株, 将pop1 和pop2 进行五轮递归原生质体融合以后, 突变株F5 与野生型相比, 对酸的耐受性增加,产生乳酸的能力也提高了3 倍。Dai 等21 利用基因组改组成功提高了Sphingobium chlorophenolicumATCC 39723 对杀虫剂五氯苯酚(PCP)的耐受性, 从而增加了它对PCP的降解能力。近年来, 随
15、着该技术研究的深入, 基因组改组对于真菌的菌种改良方面也取得了突破性的进展, Zhao 等22利用基因组改组使树状多节孢菌生产紫杉醇的能力比野生型高出64.41%。基因组重排是以整个基因组为操作对象的一种DNA重排。其本质就是进行多次的原生质体的融合和再生。美国的Zhang 首次提出了这一概念，并应用此技术提高了费氏链霉菌合成泰乐星的能力23。徐波等24人应用基因组排育种方法筛选替考拉宁高产菌，其替考拉宁的产量从原始菌株的1 825 /mL 提高到了3 016 /mL，增长了65.3%。徐波等25将普那霉素产生菌始旋链霉菌的孢子和原生质体经紫外诱变后的高产突变株进行了4 轮基因组重排育种，筛选
16、出的重排菌株普那霉素产量为832 mg/mL，比原始出发菌株提高了206%。通过基因组测序分析，已经发现在链霉菌基因组中大多数情况是生物合成基因以相近的簇形式存在26，单拷贝可扩增因子通过速率限制不对称交换以转换成重复结构。组建重组子的可扩增因子和重要基因的拷贝数，也可能提高基因产物的表达量27。ccaR 蛋白对棒状链霉菌中克拉维酸的合成具有正调控作用，由ccaR 基因编码，白小佳等28通过增加ccaR 基因剂量提高了棒状链霉菌克拉维酸的产量，突变株的产酸量是出发菌株的1.54 倍。将生物合成基因与相应的质粒载体重组，导入特定的基因工程菌，由于质粒的高拷贝，诱导表达获得高产量的抗生素。高慧英等29对吸水链霉菌17997 建立了噬菌体基因转移系统，利用基因阻断技术筛选出了与格尔德霉素生物合成相关基因的柯斯质粒，从而为格尔德霉素的生物合成基因簇的克隆奠定了基
