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1、实验十四 水中总大肠杆菌的测定1 原理总大肠杆菌群可用多管发酵法或滤膜法检测。多管发酵法的原理是根据大肠菌群细 菌能发酵乳糖，产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过 三个步骤进行检验，求得水样中的总大肠菌群数，实验结果以最可能数( most probable number),简称MPN表示。2 仪器2.1 高压蒸汽灭菌器。2.2 恒温培养箱，冰箱。2.3 生物显微镜，载玻片。2.4 酒精灯，镍铬丝接种棒。2.5培养皿(直径100mm),试管(5x150mm),小倒管，吸管(1, 5, 10ml),烧杯(200,500, 2000ml),锥形瓶(500, 1000ml),
2、采样瓶。3 培养基及染色剂的制备3.1 乳糖蛋白胨培养液：将10g蛋白胨、3g牛肉浸膏、3g乳糖和5g氯化钠加热溶于1000mL蒸馏水中，调 节pH为7.2 7.4,再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL,充分混匀，分装于试管(内有 倒管)中，于121C高压灭菌器中灭菌15min,贮存于冷暗处备用。3.2 三倍浓缩蛋白胨溶液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法制备。除蒸馏水外,各组分用量增加至三倍。3.3 品红亚硫酸钠培养基3.3.1 贮备培养基的制备于2000mL烧杯中，先将20-30g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入 3.5g磷酸氢二钾及10g蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补
3、充到1000mL调节溶液 pH至7.2-7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加10g乳糖，混匀，定量分装于250或500mL 锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在121C灭菌15m in,贮存与冷暗处备用。3.3.2 平皿培养基的制备 将上法制备的贮备培养基加热融化。根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按1：50 比例吸取5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中；再按1：200比例称取无水亚硫 酸钠，置于另一灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（灭 菌）。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色再褪 至淡红色为止（不宜加多）。将此混合液全部加入已融
4、化的贮备培养基内，并充分混匀（防 止产生气泡）。立即将此培养基适量（约15mL）倾入已灭菌的平皿内，再冷却凝固后置 于冰箱内备用，但保存时间不宜超过2周。如培养基由淡红色变成深红色则不能再用。3.4 伊红美蓝培养基制备于2000mL烧杯中，先将20g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，再加入2g磷酸 二氢钾及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至1000mL,调节溶液pH值至727.4, 趁热用脱脂棉或绒布过滤，加入2%伊红水溶液（0.4g伊红溶于20mL水中）20ml和0.5% 美蓝水溶液（0.065g美蓝溶于13mL水中）13ml，再加入10g乳糖，混匀后定量分装于 250或500m
5、L锥形瓶内，于121C高压灭菌15min,放冷至45C左右，无菌操作下将此培 养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用。3.5 革兰氏染色剂3.5.1 结晶紫染色液：将20mL结晶紫乙醇饱和溶液（称取4-8g结晶紫溶于100mL95%乙醇中）和80mL1% 草酸铵溶液混合并过滤。该溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。3.5.2 助染剂：将 1g 碘与 2g 碘化钾混合后，加入少许蒸馏水，充分振荡，待完全溶解后，用蒸馏 水补充至300mL。此溶液2周内有效。当溶液由棕黄色变为淡黄色时应弃去。为易于贮 备，可将上述碘与碘化钾溶于30mL蒸馏水中，临用前再加水稀释。3.5.3 脱色剂
6、：95%乙醇。3.5.4复染剂：将0.25g沙黄加到10mL95%乙醇中待完全溶解后，加90mL蒸馏水。4 测定步骤4.1 生活饮用水4.1.1 初发酵实验：在两个装有已灭菌的 50mL 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试 管或烧瓶中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样10mL，混匀后置于37。0恒温 箱内培养 24h。4.1.2平板分离：上述各发酵管经培养24h后，将产酸，产气及只产酸的发酵管分 别接种于伊红美蓝培养基或品红亚硫酸钠培养基上，置于37C培养箱内培养24h,挑选符 合下列特征的菌落。a. 伊红美蓝培养基上：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光 泽的菌落：淡紫
7、红色，中心色较深的菌落。b. 品红亚硫酸钠培养基上：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属 光泽的菌落；淡红色，中心颜色较深的菌落。4.1.3 取有上述特特征的群落进行革兰氏染色a、用已培养18-24h的培养物涂片，涂层要薄。b、将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液， 1min 后用水洗去。c、滴加助染剂， 1min 后用水洗去。d、滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止（约20 30s）,用水洗去。e、滴加复染剂， 1min 后用水洗去，晾干、镜检，呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红 色者为阴性菌。4、 复发酵实验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌
8、落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），每管可接种 分离自同一初发酵管（瓶）的最典型菌落1 3个，然后置于37C恒温箱中培养24h，有 产酸、产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有大肠菌群存在。根据证实 有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查表 2-5“大肠菌群检数表” ，报告每升水样中的大 肠菌群数。4.2 水源水4.2.1于各装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加 入10ml水样；于各装有10ml乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入 lml水样；再于各装有10ml乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入l
9、ml 1： 10稀释的水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37C恒温箱内培养 24h。4.2.2 平板分离和复发酵试验的检验步骤同“生活饮用水检验方法”。4.2.3根据证实总大肠菌群存在的阳性管数，查附表2-6“最可能数（MPN）表”， 即求得每100ml水样中存在的总大肠菌群数。我国目前系以1L为报告单位，故MPN值 再乘以10,即为1L水样中的总大肠菌群数。对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应作 1： 10、1： 100、1： 1000 或更高倍数的稀释，检验步骤同“水源水”检验方法。如果接种水的水样量不是10ml、1ml和0.1ml，而是较低或较高的三个浓度的水
10、样量, 也可查表求得MPN指数，再经下面公式换算成每100ml的MPN值。MPN tt=MPN指数X10 （ml） /接种量最大的一管（ml）表 2-5 大肠菌群检数表接种水样总量300ml （100ml 2份，10ml 2份）10mL水量的阳性管数100mL水量的阳性瓶数0121L水样中大肠菌群数1L水样中大肠菌群数1L水样中大肠菌群数03411138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069230表2-6最可能数（MPN）表（接种 5 份 10ml 水样、5 份 0.1ml 水样时，不同阳性及阴性情况下 100ml 水样中细菌数的最可能数和95%可信限值）出现阳性份数每100ml水样中 95%可信一出现阳性份数每100ml水样中 95%可信限值10ml管1ml管0.1ml管细菌数的最可能数下限 上限10ml管1ml管0.1ml管细菌数的最可能数下限上限00024212697800120.574302798001020.5743133119302040.51144034129310020.575002377010140.51150134118911040.511502431511011160.51551033119312060.515511461612020052400
