微生物与发酵工艺实训.doc

《微生物与发酵工艺实训.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物与发酵工艺实训.doc（34页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、微生物与发酵工艺实训 实训一 显微镜的使用和微生物测微技术 实训二 细菌形态的观察 实训三 细菌的简单染色和革兰氏染色 实训四 微生物细胞数的计数 实训五 培养基的制备与灭菌 实训六 微生物的纯种分离培养 实训七 紫外线诱变选育-淀粉酶高产菌株 实训八 固定化技术 实训九 酒精发酵 实训十 亚硫酸盐氧化法测定KL 实训十一 谷氨酸发酵的代谢曲线测定实验1 显微镜的使用和微生物测微技术 一、实验目的 1. 练习和掌握显微镜的使用方法（低倍镜、高倍镜、油镜）。2. 掌握使用测微尺测定微生物大小的方法，熟悉微生物大小的一般概念。二、显微镜的构造 图1-1 单目光学显微镜图1-2 双目光学显微镜 人的

2、眼睛只能识别大小为0.1 mm的物体。显微镜是精密的放大仪器，是生物学研究不可缺少的工具。我们用它可以观察肉眼看不见的微小生物的结构。最常用的是光学显微镜，为了正确操作、妥善保管和维护显微镜，延长使用年限，我们必须首先了解显微镜的结构和功能。一台显微镜包括机械系统和光学系统两大部分。现在一般实验室里常用的，是以图1-2为代表的双筒光学显微镜。现以它为例详述显微镜结构和功能如下。（一）机械部分1镜筒 显微镜上部圆形中空的长筒，筒口上端安装两个相同放大倍数的目镜，下端与物镜转换器相连，作用是保护成像的光路与亮度。由于观察者的瞳距有所不同，双筒显微镜多配有瞳距调整装置。2转换器固定在镜筒下端，分两层

3、，上层固定不动，下层可自由转动。转换器上有24个圆孔，用来安装不同放大倍数的物镜。3.物镜安装在转换器下半部分的透镜，多为放大倍数不同的四个。可通过旋转转换器改变观察用物镜。4粗准焦螺旋在镜臂的下部，直径较大。通过转动粗准焦螺旋，使载物台上下移动，从而粗略的调节像距。5细准焦螺旋在镜臂的下部，一般与粗准焦螺旋同心安装，直径较小。它调整像距的范围较粗准焦螺旋小，可以精细调整像距。6镜座显微镜的底部、镜臂下方呈马蹄形的金属座，用以稳固和支持镜身。7镜柱从镜座向上直立的短柱。上连镜臂，下连镜座，可以支持镜臂和载物台。8载物台从镜臂向前方伸出的金属平台。呈方形或圆形，是放置载玻片或标本的地方。中央有通

4、光孔，通光孔左右各有一个弹性的金属压片夹，用来固定载玻片。9. 推进器较高级的显微镜，在载物台上常具有推进器，它包括夹片夹和推进螺旋，除夹住切片外，还可使切片在载物台上左右方向和上下方向移动。（二）光学系统1目镜 又叫接目镜。它是安装在镜筒上端的凸透镜镜头。每台显微镜的目镜都配有一套，一般包括例如 5、10、15、20。镜筒上只能安装一个目镜，通常选择10。2物镜是决定显微镜质量的关键部件。安装在转换器的孔上，也是由一组透镜组成的，能够把物体清晰地放大。一般转换器上同时安装三个或4个放大倍数不同的物镜，即：低倍物镜（4、8或10）、高倍物镜（40或45）和油浸物镜（90或100），根据需要选择

5、使用。3光源双目显微镜采用电灯作为光源，并可调整光源亮度。在不使用显微镜作观察时，应尽量关闭光源，以延长灯泡使用寿命。对于单目显微镜，光源由反光镜承担，它是安装在聚光器下面的一个可作各种方向的翻转的一面平、另一面凹的双面圆镜，反射光线以供观察。光线较强时使用平面镜，反之使用凹面镜。4聚光器聚光器是安装在载物台下面的一个凸透镜，可集中光源投射来的光线。在载物台下方有一个聚光器调节螺旋，它可以使聚光器升降，用以调节光线的强弱，下降时亮度降低，上升时亮度加强。5虹彩光圈又称可变光阑，由多数金属片组成。使用时移动其把柄，可控制聚光器透镜的通光范围，用以调节光的强度。虹彩光圈下常附有金属圈，其上装有滤光

6、片，可调节光源的色调。6遮光器有些简单的显微镜无聚光器和虹彩光圈，而是装有遮光器。遮光器呈圆盘状，上面有大小不等的圆孔（光圈）。光圈对准通光孔，可以调节光线的强弱。7.在转换器上方、与镜筒相接的部位，其内部有光亮度很高的平面镜，将从物镜透射进来的光线反射进目镜中。三、实验原理 （一） 显微镜的工作原理1.显微镜的成像原理 显微镜的放大作用是由物镜和目镜共同完成的。标本经物镜放大后，在目镜的焦平面上形成一个倒立的实像，再经目镜的进一步放大形成一个虚像，被人的眼睛所观察到。图1-3 显微镜成像原理2.影响显微镜放大效果的因素 数值孔径（numerical aperture，N.A.）：N.A.=n

7、sin/2,其意义为物镜与标本间介质折射率n和光的最大入射角半数正弦的乘积。n是影响数值孔径的因素，空气的折射率n=1.0，水的折射率n=1.33，香柏油的折射率n=1.515，玻璃的折射率n=1.52。 显微镜的性功能还依赖于物镜的分辨率，即能分辨两点之间的最小距离的能力。分辨率用表示，=/2N.A.。增大数值孔径，缩短波长可提高显微镜的分辨率，使标本的细微结构更清晰可见。事实上，可见光的波长（380700nm）是不可能缩短的，只有靠增大数值孔径来提高分辨率。 物镜上标有：N.A.1.25、100、OI、160/0.17、0.16等字样，其中“N.A.1.25”为数值孔径1.25，“100”

8、为放大倍数100，“160/0.17”表示镜筒长160mm、盖玻片厚度0.17mm，“OI”表示油镜，“0.16”表示工作距离0.16mm。 3.油镜工作原理 即使采用高倍（4510）放大时，多数细菌仍看不清，所以必须用放大倍数更大的油镜（10010）观察。在用油镜观察时必须要把油镜头（100）浸入香柏油中，香柏油的折射率（1.515）与玻璃片折射率（1.52）相近似，因此在物镜（玻璃）与标本载片（玻璃）之间加入香柏油可以使光线不致因从一个介质（玻璃）进入到另一折射率不同的介质即空气（折射率为1.0）而引起部分散射，造成观察不清楚。这对透镜弯曲度较大，直径较小（通过光线亦较小）的油镜头是特别重

9、要的。（二） 微生物菌体大小的测量原理微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，因此测定微生物细胞的大小在了解微生物的形态特征及其分类鉴定方面，是一项重要的内容。 测定微生物菌体时要用到镜台测微尺、目镜测微尺和显微镜。1. 目镜测微尺目镜测微尺是一圆形玻片，其中央刻有一细长的等分为50格（或100格）的标尺(图1-4)，测量时将其放在接目镜的隔板上。因此，目镜测微尺不是直接测量细菌而是观测显微镜放大的物象。由于不同的显微镜放大倍数不同，故目镜测微尺每格实际代表的长度随显微镜放大倍数不同而异。这样，在使用前须用镜台测微尺校正，以求得在一定接物镜及接目镜等光学系统下目镜测微尺实际测量的长度。2.

10、 镜台测微尺镜台测微尺(图1-4)是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将1mm等分为100格，每格等于0.01mm(10m)，专门用于校正目镜测微尺每格所代表的镜台测微尺的长度。图1-4 目镜测微尺和镜台测微尺四、实验材料和用具 （一）材料1.枯草芽孢杆菌染色涂片。2.金黄色葡萄球菌涂片。3.酵母菌染色涂片。（二）用具 显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、二甲苯、香柏油、擦镜纸五、实验方法 （一）显微镜的使用方法取镜时右手握住镜臂，左手托住镜座。 把显微镜放在水平的实验台上，略偏左（显微镜放在距实验台边缘7厘米左右处）。 将标本片放在载物台上，使观察的目的物处于圆孔的正中央。 旋转粗准焦螺旋将载

11、物台上提，眼睛在侧向注视物镜，防止物镜和载玻片相碰。 通过目镜两眼同时观察，如果见到目的物，但不十分清楚，可旋转细准焦螺旋至目的物清晰为止。使用单筒显微镜，应习惯用左眼观察，以便右眼绘图。 使用高倍镜前，必须先用低倍镜观察，发现目的物后将目的物移至视野正中处。 旋动转换器换高倍镜。如果高倍镜触及载玻片立即停止旋动，这说明原来低倍镜并没有调准，目的物并没有真正找到，必须用低倍镜重新调节。如果高倍镜下观察目的物有点模糊，调节细准焦螺旋，直到视野清晰。调节细准焦螺旋时要注意旋转方向与载物台上升或下降的关系，防止镜头与载玻片强力接触，损坏镜头或载玻片。 如果用高倍镜目的物未能看清，可用油镜。先用低倍镜

12、和高倍镜检查标本片，将目的物移到视野正中。 在载玻片上滴一滴香柏油（或液体石蜡），将油镜移至正中使油镜头浸没在油中，刚好贴近载玻片。用细准焦螺旋微微向上调（切忌不用粗准焦螺旋）即可。 油镜观察完毕，用擦镜纸将镜头上的油揩净，另用擦镜纸蘸少许二甲苯揩拭镜头，再用擦镜纸揩干。 （二）显微镜使用注意事项 显微镜应置于平坦的桌面上。如使用单目显微镜，照明可采用间接日光（即非直射日光）或灯光。一手旋动粗准焦螺旋，一手转动反光镜；还可以使用聚光器（上升或下降）及光圈（放大或缩小）以获得视野中的理想亮度。 将标本片夹在显微镜载物台的十字夹中，注意要正面向上。 先用低倍镜再用高倍镜观察寻找目的物，此时要控制视

13、野不能太亮，注意区别镜头上的灰尘和目的物。 在标本中央滴加一小滴香柏油，从镜筒侧面观察，将油镜（100）轻轻旋下，使它浸在香柏油内。切勿猛烈的将镜头压在标本片上，防止损坏物镜！滴加香柏油时须注意：（a）香柏油不宜过多，仅需一滴即可。（b）自瓶中取出时，切勿搅动。滴到玻片上时，不要涂抹，以免形成气泡。 注意在旋动粗准焦螺旋时，必须特别小心。决不能在观察时将载物台很快提升，以免损伤螺旋。 假如用油镜时一再看不清目的物，可验看油中是否存在气泡。如存在气泡，可将镜头及标本片上的油擦去，重新滴加。 观察完毕后，下降载物台，取下标本片，用干净的擦镜纸蘸少量的二甲苯，轻揩去载玻片上的香柏油后，立即用干擦镜纸

14、揩干。有些标本片没有使用盖玻片，在揩去标本片上所沾的香柏油时应格外小心。可先用擦镜纸吸去油滴，然后用干擦镜纸滴上少量二甲苯，轻轻在玻片上拖动几次后，就能揩净又不至损伤标本片。 收存显微镜时，应将最短的镜头对准透光孔，或将物镜的长镜头转成“八”字式，使两个镜头同时搁在载物台上。切勿将长镜头对准透光孔，以免与聚光器相碰而损坏。镜台、镜身上占有水及污物，必须及时擦去。最后套上显微镜罩。 （三） 微生物大小的测量1. 目镜测微尺的校正将目镜测微尺装入目镜的隔板上，使刻度朝下；把镜台测微尺放在载物台上使刻度朝上。用低倍镜找到目镜测微尺的刻度，移动镜台测微尺和旋转目镜测微尺，使两者的第一条刻度线重合，顺着

15、刻度找到另一条重合刻度线。计算在该放大倍数下目镜测微尺每个小格的实际长度。例如，目镜测微尺的5格等于镜台测微尺的2格(即20m)。则目镜测微尺1格21054m。在低倍镜下求出目镜微尺每格长度后，再用同法求出在高倍镜下和油镜下(镜台测微尺上需加1滴香柏油)目镜测微尺每格的长度。 图1-5 用镜台测微尺校正目镜测微尺2. 菌体大小的测量将镜台测微尺取下，换上标本片，选择适当的物镜测量目的物的大小，分别测出菌体的长和宽各占目镜测微尺的格数，再按照目镜测微尺1格的长度计算出菌体的长度和宽度，即可得到标本（菌体）的大小。六、实验报告 低倍镜：目镜测微尺格=镜台测微尺格，目镜测微尺每格=m高倍镜：目镜测微尺格=镜台测微尺格，目镜测微尺每格=m油镜：目镜测微尺格=镜台测微尺格，目镜测微尺每格=m枯草芽孢杆菌在油镜下：长=目镜测微尺格=