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1、SDS-PAGE检测蛋白质纯度1 电泳的基本原理许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，因此，在一定时间内，由于各组分移动距离的不同，而达到分离鉴定各组分的目的。 2 影响电泳的主要因素2.1 电泳介质的pH 当介质的pH等于某种两性物质的等电点时，该物质处于等电状态，即不向正极或负极移动。当介质pH小于其等电点时，则呈正离子状态，移向负极；反之，介质pH大于其等电点时，则呈负离子状态，移向正极。因此，任何一种两性物质的混合物电泳均受介质pH的影响，
2、即决定两性物质的带电状态及其量，为了保持介质pH的稳定性，常用一定pH的缓冲液，如分离血清蛋白质常用pH86的巴比妥或三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液。 2.2 缓冲液的离子强度 离子强度对电泳的影响是：离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰。如离子强度过低，缓冲液的缓冲量小，不易维持pH的恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量(压缩双电层)使电脉速度减慢。所以常用离子强度为0.02-0.2之间。 2.3 电场强度 电场强度和电泳速度成正比关系。电场强度以每厘米的电势差计算，也称电势梯度。如纸电泳的滤纸长15cm，两端电压（电势差）为150V，则电
3、场强度为150/15=10V/cm，电场强度愈高，则带电粒子的移动愈快。电压增加，相应电流也增大，电流过大时易产生热效应可使蛋白质变性而不能分离。2.4 电渗作用 在电场中，液体对固体的相对移动，称为电渗。如滤纸中含有表面带负电荷的羧基，溶液则向负极移动。由于电渗现象与电泳同时存在，所以电泳的粒子移动距离也受电渗影响，如纸上电泳蛋白质移动的方向与电渗现象相反，则实际上蛋白质泳动的距离，等于电泳移动距离减去电渗距离。如电泳方向和电渗方向一致，其蛋白质移动距离，等于二者相加。电渗现象所造成的移动距离可用不带电有色染料或有色葡聚糖点在支持物的中间，观察电渗方向和距离。 2.5 对支持物的选择 一般要
4、求支持物均匀，吸附力小，否则电场强度不均匀，影响区带的分离，实验结果及扫描图谱均无法重复。如纸电泳时，滤纸厚薄不均匀或吸附力过大，则蛋白质或其他胶体颗粒在它们泳动过程中有一部分被滤纸吸附，造成分离区带蛋白含量相对量降低。因此，电泳前应事先处理滤纸，以减低滤纸的吸附能力，可取得较好的分离效果。若选用Whatwan No1号滤纸或国产新华滤纸，一般不需要进行预处理。2.6 温度对电泳的影响 电泳过程中由于通电产生焦尔热，热对电泳有很大的影响。温度升高时，介质粘度下降，分子运动加剧，引起自由扩散变快，迁移率增加。温度每升高1度，迁移率约增加2.4。为降低热效应对电泳的影响，可控制电压或电流，也可在电
5、泳系统中安装冷却散热装置。3 电泳的分类3.1 按分离原理分类 可分为区带电泳、移界电泳、等速电泳和聚焦电泳4种。1） 区带电泳 电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液中分离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳技术。2） 移界电泳 是Tiselius最早建立的电泳，它是在U型管中进行的，由于分离效果较差，已为其它电泳技术所取代。3） 等速电泳 需专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各区带相随分成清晰的界面，并以等速移动。4） 等电聚焦 由于具不同等电点的两性电解质载体在电场中，自动形成pH梯度，使分离物移动至各自等电点的pH处聚集成很窄的区带，且分辨率较高。从表面看与区带电泳相似，但原理不同。3
6、.2 区带电泳的分类1） 按支持物物理性状分类 1. 滤纸及其他纤维素膜如乙酸纤维膜、玻璃纤维膜、聚胺纤维膜电泳。 2. 粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。 3. 凝胶电泳，如琼脂糖、琼脂、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 4. 丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。2） 按支持物的装置形式不同分类 1. 平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式。2. 垂直板式电泳。3. 连续流动电泳，首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，缓冲液和样品自顶端下流，与电泳方向垂直。可分离较大量的蛋白质。以后有用淀粉、纤维素粉、玻璃粉等代替滤纸，分离效果更好。3） 按pH的连续性不同分类 1.
7、 连续pH电泳：电泳全部过程中缓冲液pH保持不变。如纸电泳、乙酸纤维膜电泳。 2. 不连续pH电泳：缓冲液与支持物之间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳、等电聚焦电泳、等速电泳等，能使分离物质区带更加清晰，并可作ng级微量物质的分离。不连续电泳与连续电泳的主要区别在于前者有两层不同孔径的凝胶系统；电极槽中及两层凝胶中所用的缓冲液pH值不同；电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。而后者在这三个方面都是单一或是均匀的。4 几种常见的电泳方法4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis）是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳，
8、这种凝胶由丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N-甲叉基（亚甲基）双丙烯酰胺（N，N-methylene-bis-acrylamide，简称Bis)聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，弹性大，透明，化学稳定性高，无电渗作用，设备简单，用样量少（1-100g）和分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例聚合成孔径大小不同的凝胶，可用于蛋白质、核酸等物质的分离、定性和定量分析。还可结合去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS），以测定蛋白质亚基分子量。聚丙烯酰胺的聚合反应及其结构如下：图 APS引发TEMED催化Acr与Bis的聚合反应Acr或Bis无论单独存在或混合在一
9、起都是稳定的，一旦出现自由基团时，就会发生聚合反应。自由基团的引发有化学和光合两种方法，化学法的引发剂是过硫酸胺（简称Aps），催化剂为四甲基乙二胺（简称TEMED）；光化学法是在光线照射下，由光敏感物质核黄素来引发，催化剂也是TEMED。由于单体及交联剂、引发剂和催化剂的浓度、比例、聚合条件等的不同，便可产生不同孔径的凝胶。一般而言，凝胶浓度愈大，交联度愈大孔径愈小。凝胶浓度的选择与被分离物分子量及其性质有关，其大致选用范围如下表：表: 分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度（%）蛋白质 510520 3015 2010 155 10 2 5核酸（RNA）蛋白质-甘氨酸-。由于C
10、l-的快速移动，使在Cl-后面胶层中的离子浓度骤然降低，形成一个低电导或称高电位梯度（电位差）区域（电势梯度E=电流强度I/电导率），因为电泳速度取决于电位差和有效迁移率，所以在此区域中，使蛋白质离子及甘氨酸离子加速向阳极移动。当快离子、慢离子和蛋白质的迁移率与电位梯度的乘积彼此相等时，则3种离子移动速度相同。在快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立之后，则在快离子和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面。也就是说，在高电位梯度和低电位梯度之间形成一个迅速移动的界面（见图24）。由于蛋白质离子的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，因此就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩成很窄的薄层。此
11、浓缩效应使蛋白质浓缩了数百倍。在分离胶层中，因缓冲液pH为8.9，甘氨酸进入此胶层后，其解离度大大增加，它的迁移率几乎与Cl-接近。此外，分离胶孔径小，蛋白质在泳动时，所受阻力较浓缩胶中大，移动缓慢。由于这两个原因，使甘氨酸离子在分离胶中有效迁移率超过蛋白质离子，导致分离胶不具备浓缩胶效应，而只有分离效应。 2. 分子筛效应 由于在凝胶电泳中，凝胶浓度不同，其网的孔径大小也不同，可通过的蛋白质分子量范围也就不同。在分离胶中孔径较小，分子量和构型不同的蛋白质分子，通过一定孔径的凝胶时所受阻力不同，从而引起泳动速度的变化，所以多种蛋白质即使所带电荷相同，迁移率相等，在聚丙烯酰胺中经一定时间泳动后，也能彼此分开。大分子受阻程度大，走在后面，小分子受阻小，走在前面。 3. 电荷效应 由于各种蛋白质所带电荷不同，有效迁移率也不同，它们在浓缩胶和分离胶交界处被浓缩成狭窄区带，仍以一定程序排列成各自的小圆盘状，紧接在一起。当它们进入分离胶时，由于电泳体系已处于一个均一的连
