《微波辅助萃取—气相色谱—质谱联用分析石蒜中的加兰他敏.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微波辅助萃取—气相色谱—质谱联用分析石蒜中的加兰他敏.doc（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、微波辅助萃取气相色谱质谱联用分析石蒜中的加兰他敏汪军霞 李攻科*基金项目 中山大学化学与化学工程学院第三届创新化学实验基金项目（批准号：02015）资助第一作者 汪军霞（1982年出生），女，中山大学化学与化学工程学院化学专业99级指导教师 李攻科教授 Email：中山大学化学与化学工程学院,分析科学研究所，广州，510275摘要 建立了微波辅助萃取（MAE）/气相色谱质谱联用法(GC-MS)分析石蒜中加兰他敏的方法.选取合适的萃取溶剂类型，采用了四因素三水平的正交设计实验对样品颗粒度、萃取溶剂体积、微波萃取的时间和控制温度四个实验条件进行了优化.方法平均回收率99.3 %，检出限3.42 m
2、gL-1，RSD为4.4 %(n=6)，线性范围10 100 mgL-1(r=0.9996).并将本方法与乙醇加热回流提取法相比，结果表明本方法省时、精密度好、操作简便，适合于石蒜中加兰他敏的快速测定.关键词 微波辅助萃取（MAE），加兰他敏，气相色谱-质谱联用（GC-MS），石蒜1952年前苏联科学家Proskurnian和Yakovleva1首次从石蒜属植物雪花莲的鳞茎中分离出了菲啶类生物碱加兰他敏. 它是一种可逆性胆碱酯酶（ChE）抑制剂，其作用比毒扁豆碱弱，但能选择性地抑制真性胆碱酯酶（AChE）. 最近的医学研究指出2加兰他敏有助于改善早老性痴呆患者的认知能力，可以作为治疗轻、中度阿
3、尔茨海默氏病（AD）的药物.随着老龄化社会的来临,早老性痴呆病人所占的比例将逐渐增多，因此研究加兰他敏具有重要的现实意义和工业前景.加兰他敏的分离检测方法有薄层色谱3（TLC）、高效液相色谱4（HPLC）、气相色谱法5（GC）、免疫分析法6（IA）、高效毛细管电泳7（HPCE）、联用方法8等多种技术. 其样品预处理常采用乙醇热提法9提取石蒜中的生物碱，这种方法能耗高、原辅料损耗大、生产周期长，而且加兰他敏提取不完全. 微波辅助萃取（MAE）利用微波加热均匀、高效、选择性好的特点对目标物进行萃取分离.该技术快速、高效、操作简便、污染小、成本低、应用范围广，已被广泛应用于植物中有效成分的提取10.
4、 本文选择石蒜中加兰他敏作为研究对象，采用正交实验设计优化了MAE 的条件，建立了微波辅助萃取（MAE）/气相色谱质谱联用法(GC-MS)分析石蒜中加兰他敏的方法，并与传统的乙醇热提法进行了比较研究.1 实验部分1.1 仪器及操作条件仪器：MK-型压力自控微波炉（上海新科微波技术应用研究所）；Mars型微波炉（CEM，USA）；R201旋转蒸发仪（上海申科机械研究所）；HP-6890气相色谱仪带质谱检测器（MSD-5973）配G1701B.02.05工作站（Hewlett-Packard，USA），所用色谱柱为DB-5MS熔融毛细管柱（J&W，CA）.色谱条件：采用程序升温，柱升温程序为：初温
5、150 ，保持3 min，然后以6 / min的速度升至300 ，保持5 min. 进样口温度250 ，不分流进样. 载气为高纯氦气，恒定流速1.0 mL / min.质谱条件：接口温度280 ，离子源，电子能量70 eV，离子源温度230 ，四极杆温度150 ，质量扫描范围50 550 amu，以峰面积定量.1.2 试剂和样品氢溴酸加兰他敏标准品：购自Sigma公司. 甲醇、乙醇、石油醚（沸程：90 120 ）、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、盐酸、浓氨水、碳酸钠（分析纯试剂，广州化学试剂厂）. 石蒜：棕黑色片状物，有特殊香味.1.3样品处理过程前处理：将石蒜样品用粉碎机粉碎，过筛，按 20 mesh
6、,20 40 mesh,40 60 mesh, 60 mesh分别装入袋中，储存在干燥器中.微波辅助萃取：准确称取1 g石蒜样品放入萃取内罐中，加入一定体积的萃取溶剂，放入萃取外罐中，旋好外盖，放入微波炉中，在一定的控制温度下萃取一定时间. 冷却后，取出萃取罐，将萃取液过滤，再旋转蒸发至近干，用甲醇定容至5 mL，取1 L用GC-MS测定.乙醇加热回流萃取：准确称取1 g石蒜样品，放入圆底烧瓶中，加入一定体积的萃取溶剂，水浴加热回流2 h，冷却过滤，再旋转蒸发至近干，用甲醇定容至5 mL，取1 L用GC-MS测定.1.4 定性和定量实验采用未经衍生化的GC-MS按仪器操作条件进行定性，以峰面积
7、定量.不分流进样，进样量1 L.(a)(b)图1 (a)加兰他敏甲醇标准溶液色谱图 (b)石蒜样品的甲醇溶液色谱图（标记为1的是加兰他敏的峰）2 结果与讨论2.1 微波萃取溶剂的选择萃取溶剂的选择是萃取过程中最重要的一环. 所选择的萃取溶剂一方法要能够定量的从样品基体中将待测物分离萃取出来，另一方面要方便于后续处理过程. 传统方法中溶剂的选择往往根据“相似相溶”的原则，但在应用MAE时，所选择的溶剂还须具有吸收微波及将微波转化为热能的能力. 对微波的吸收与永久偶极子在电磁场中的重排有关，因此溶剂必须有介电极性才能吸收微波，即溶剂吸收微波的能力与溶剂的介电常数（）相关，一般的，溶剂的介电常数越大
8、即极性越大，对微波的吸收能力越强. 在选择萃取溶剂时，还需要考虑随后续反应的影响. 例如，高沸点的溶剂浓缩困难；而极性高的溶剂选择性差，共萃取物干扰严重，需要严格的净化过程. 参照传统方法，结合微波加热的要求，我们选择了甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和水作为微波萃取的溶剂，按照上文中提及的密闭微波萃取的处理步骤进行了溶剂的优化. 其分析结果如下：表1 不同溶剂萃取效率的比较溶剂甲醇乙醇丙酮乙酸乙酯加兰他敏的含量0.0232 0.0064 其中丙酮和乙酸乙酯的提取物中检测不出加兰他敏的峰，主要是因为石蒜中的生物碱大部分以盐的形式存在，这些盐在这些溶剂中几乎不溶. 而对于水来说，我们发现微波提取后呈现
9、糊状，这种情况可能是由于淀粉含量过高所致，固液分离非常麻烦，我们曾经尝试改变溶液的pH值来改变这种情况，但发现效果不大. 而甲醇的提取效率比乙醇要高，其原因可能主要是甲醇的介电常数比乙醇的大，利用微波的效能要高于乙醇，另外生物碱的盐在甲醇中的溶解度远远大于乙醇.所以选择甲醇作为石蒜中加兰他敏微波密闭提取的溶剂是比较合适的.2.2 微波条件的优化对于密闭微波萃取来说，我们考虑的优化条件主要有植物粉碎后的颗粒度、溶剂体积、控制温度和辐射时间，进行的四因素三水平的正交实验结果如下：为了优化微波条件，本实验就样品颗粒度（20 40 mesh，40 60 mesh， 60 mesh）、甲醇溶剂体积（10
10、 mL、20 mL、30 mL）、微波辐射温度（65 、75 、85 ）及微波辐射时间（5 min、15 min、25 min）进行四因素三水平的正交实验设计，如表2.表2 微波萃取条件的正交实验设计及峰面积结果（OAD9(43)）实验号颗粒度mesh溶剂体积 mL辐射温度辐射时间min峰面积相对峰面积120 40106551190630236.8220 402075152139457666.1320 403085252701214583.5440 601075252263187869.9540 602085532366940100640 603065153147510697.27 60108
11、5151890484158.48 602065252198145967.99 60307552535062978.3由表可知,实验5的萃取效率最高.为了使结果更加清晰明了，将各因素的各个水平的回收率之和（Ki）及其平均值（ki）列于表3.表3 各因素不同水平对应的峰面积之和及平均值（%）颗粒度mesh溶剂体积mL辐射温度辐射时间minK160313023534430216536286769623871K286473924757429756937708371774523K366236929838378807828392671625482k12010434117814340217876222320
12、7957k228824641252476582312569423924841k322078976279459602609464223875161注：Ki峰面积之和；ki峰面积平均值.为找出微波萃取时影响萃取效率的关键因素，对正交实验结果进行综合分析，见图2.图2 颗粒度、溶剂体积、控制温度、辐射时间于萃取效率（峰面积）的影响由图2可知，前三种因素的不同水平对应的萃取效率和相差较大，说明前三种因素对于微波萃取效率均有影响.其中颗粒度40 60 mesh是比较合适的，粒度太大微波穿透深度不够，加热效率不高，萃取溶剂与样品之间接触面积较小，使得萃取不完全；粒度太小则容易发生粘结吸附的现象，萃取溶剂难
13、于完全渗入样品中，降低萃取效率，且较难过滤，造成目标萃取物的损失.萃取效率随溶剂体积的增大而提高，但体积超过20 mL以后效率提高不是很明显.温度比较高的时候溶剂的渗透能力较强，提取效率会升高，本实验中85 时提取效率是最高的，而温度继续升高时微波罐容易发生溶剂泄漏.本实验中三个辐射时间水平的萃取效率相差不大，说明辐射时间对萃取效率的影响不大.所以本实验优化的微波萃取条件为：粒度为40 60 mesh、溶剂体积为20 mL、辐射温度为85 、辐射时间为5 min.2.3 线性范围和检出限精密称取加兰他敏标准品1 mg，用甲醇溶解，定容到10 mL，作为储备液.精密量取该储备液10 L、20 L
14、、40 L、60 L、80 L于样品瓶中，用高纯氮气吹干溶剂，再加入甲醇0.1 mL，摇匀后按1.4中所述方法进行检测.以浓度对峰面积作工作曲线，用最小二乘法得线形回归方程为：Y=1.6524106X1.2784107，r=0.9996（n6），结果表明加兰他敏浓度在10 100 mgL-1的范围内呈现良好的线性关系.用10 mgL-1的加兰他敏标准溶液连续进样6次，取仪器信噪比的3倍，得检出限为3.42 mgL-1 .2.4 回收率实验称取已知含量的石蒜样品1 g，定量加入加兰他敏标准品，按1.3所述方法，以优化的微波萃取实验条件进行处理，再按1.4中所述方法进行检测.计算回收率，结果平均回收率为99.3 %，RSD为7.9 %（n6）.2.5 重现性实验称取石蒜样品1 g，按1.3所述方法，以优化的微波萃取实验条件进行处理，再按1.4中所述方法进行检测.结果重现性令人满意，RSD为4.4 %（n6）.2.6 和传统方法的对比为了进一步对方法进行确证，本实验分别取1 g样品，用微波萃取方法与传统的乙醇加热回流萃取方法进行了比较，结果见表4.表4 微波萃取法与乙醇加热回流萃取法测定加兰他敏的结果比较加兰他敏的含量/ mgL-1RSD/%(n=6)萃取时间/min微波
