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1、谷氨酸发酵生产谷氨酸发酵一、实验目的谷氨酸（glu tamic acid）是最先成功地利用发酵法进行生产的氨基酸。谷氨酸发酵是典型的代谢调控发酵，其代谢途径相对研究得比较清楚。因此，了解谷氨酸 发酵机制，掌握其发酵工艺，将有助于对代谢调控发酵的理解，有助于对其他有氧 发酵的理解和掌握，也有助于对已掌握的生化、微生物知识的融会贯通。通过本次实验，掌握有氧发酵的一般工艺，熟练掌握通用机械搅拌罐的设备使 用。二、实验原理1、谷氨酸发酵机制谷氨酸发酵是菌体异常代谢的产物，菌体正常代谢失调时，才能积累谷氨酸。 在正常的微生物代谢中，由葡萄糖生成的磷酸烯醇式丙酮酸比天冬氨酸优先合成谷 氨酸。谷氨酸合成过量
2、时，谷氨酸抑制谷氨酸脱氢酶的活力和阻遏柠檬酸合成酶的 合成，使代谢转向天冬氨酸的合成。天冬氨酸合成过量后，反馈抑制磷酸烯醇式丙 酮酸羧化酶的活力，停止草酰乙酸的合成。所以，在正常情况下，谷氨酸并不积 累。谷氨酸生产菌由葡萄糖生物合成谷氨酸的途径见图5-7。它包括糖酵解途径（EMP途径）、磷酸己糖途径（HMP途径），三羧酸循环（TCA循环）、乙醛酸循环，伍 德-沃克曼反应（CO的固定反应等）。2苗晡椰f-确酸1礴腹细浙拋酸戊林$瞒愤合咸途径由于谷氨酸生产菌生理方面有以下共同特征，体内的代谢控制平衡被打破 使谷氨酸得以积累。?谷氨酸生产菌大多为生物素缺陷型。谷氨酸发酵时，糖酵解经过EMP 及HMP
3、两个途径进行。生物素充足时，HMP途径所占比例是38%, 控制生物素亚适量的结果，发酵产酸期，HMP途径所占比例下降到约 为26%, EMP途径所占的比例得以提高。通过控制生物素亚适量，更 重要的是由生物素促进的脂肪酸及磷脂合成减少，谷氨酸向膜外漏出， 引起代谢失调，使谷氨酸得以积累。?谷氨酸生产菌的CO固定反应酶系活力强，可通过羧化作用（更多地2 供应固定CO生成苹果酸或草酰乙酸转化成柠檬酸。2? 谷氨酸生产菌的异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，使进入谷氨酸生成期后的乙醛酸循环弱，使异柠檬酸更多地转化成a-酮戊二酸。?谷氨酸产生菌应丧失或仅有微弱的a-酮戊二酸脱氢酶活力，使a-酮戊 二酸不能继续
4、氧化。但谷氨酸脱氢酶活力很强，同时NADPH氧化能力2 弱，这样就使a-酮戊二酸到琥珀酸的过程受阻，在有过量铵离子存在 时，a-酮戊二酸经氧化还原共轭的氨基化反应生成谷氨酸而分泌泄漏 于菌体外。? 谷氨酸产生菌不利用菌体外的谷氨酸，谷氨酸最终得到积累。2、谷氨酸发酵工艺三、谷氨酸发酵方法(一) 谷氨酸菌种的制备1、斜面种子的制备(1) 斜面培养基配方:葡萄糖 0.1,;蛋白胨 1,;牛肉膏 1,;氯化钠 0.5,; 琼脂 2,;pH 7.0。(2) 接种后于30?恒温培养24 h,备用。2、一级种子的制备(1) 培养基配方:葡萄糖2.5%;尿素0.5%;硫酸镁0.04%;磷酸氢二钾0.1%;-
5、6玉米浆2.5%,3.3% (按质增减)；硫酸亚铁、硫酸锰各2 X10 g/L;pH 7.0。(2) 用1000 ml三角瓶装300 ml培养基，封口膜封口，0.1 MPa灭菌30 min， 接种后 30?、120 r/min 培养 12 h。(3) 种子质量标准：AA560(560 nm吸光度净增值)0.5;pH 6.4?0.1。3、二级 种子的制备(1) 培养基配方：葡萄糖2.5%;尿素0.5%;硫酸镁0.04%;磷酸氢二钾0.16%; -6玉米浆2.5% (按质增减) ;硫酸亚铁、硫酸锰各2 X10 g/ L(0.0002,);pH 7.0。（2）用1000 ml三角瓶装300 ml培养
6、基，封口膜封口，0.1 MPa灭菌30 min, 接种量为10,（300 ml培养基中接入一级菌种30 ml），接种后30?、120 r/min 培养 7,8 h。（3）种子质量标准：AA560 0.6;pH 7.2;无杂菌检查阴性（镜检、平板涂布）;噬菌体检查阴性（斑点试验法）。二级种子培养结束时，无杂菌或 89噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为10-10 /ml。镜检:a、用无菌操作方式取发酵液少许涂布在载玻片上，b、自然风干后用番红或草酸铵结晶紫染色1, 2 min水洗，c、干燥后在油镜下观察。平板涂布检查:a、配制营养琼脂培养基，蛋白胨1,牛肉膏0.3,NaCl0.5
7、,琼脂2,pH7.2,灭菌倒平板，b、取少量待检发酵液经稀释后涂布在营养琼脂平板上适宜 条件下培养,c、观察菌落形态。噬菌体检查,斑点试验法,:a、培养基:葡萄糖0.1,蛋白胨1,牛肉膏1,NaCl 0.5,琼脂2,pH7.0b、采用混菌法制备好混有发酵菌种的平板再用接种环或无菌吸管取少许发酵液在平板上点种培养后观察是否有噬菌斑出现。（二）谷氨酸发酵1、发酵培养基葡萄糖 13,;尿素 2,;磷酸二氢钾 0.1,;硫酸镁 0.06,;硫酸亚铁、-6 硫酸锰各 2 X10 g/(0.0002,)L;玉米浆 0.6,。2、发酵工艺参数(1) 装料系数:0.7(30 L发酵罐装料20 L)。(2) 培
8、养基灭菌：实消。0.1 MPa灭菌30 min。(3) 接种:火焰封口法。(4) 接种量:10,。(5)发酵过程工艺控制表1发酵过程工艺控制时间/min温度厂cpH搅弊转速0-150327.5250327.2300600 L3S0347. 23001380 -240367. 0200? pH控制：酸碱调节。2 mol/ L NaOH溶液(称取80 g NaOH溶于100 mL 蒸馏水中)；1 mol/ L HCl溶液(量取36 mL盐酸溶于64 mL蒸馏水中)。? 罐压:0.03,0.05 MPa? 消泡:(6)发酵过程分析发酵过程中，按以下频次测定、记录以下指标(按表2-1要求及时记录):p
9、H、风量、还原糖、A、温度1次/小时560谷氨酸含量1次/4 h,发酵12 h起开始(7)质量检测:每4h检查一次，无杂菌检查，噬菌体检查。 (8)放罐:达到放罐标准后，及时放罐。放罐标准:残糖在1,以下且糖耗缓慢(0.15, / h)或残糖0.5,。（三）谷氨酸提取1、谷氨酸浓度测定1.1 原理L-氨基酸与茚三酮共热可发生特有的氨基酸显色反应，产物显示其特有的蓝紫 色。不同谷氨酸与茚三酮反应得到的显色产物的最大吸收波长不同，即入max不同; 加之显色深浅不同，反应出相应氨基酸的不同含量。以此为依据，可为L-谷氨酸 定性及定量。在pH 5,6范围内氨基酸的显色反应最灵敏。1.2标准样品的制备L
10、-谷氨酸纯品梯度稀释溶液:分别称取0. 05,0. 5 g分析纯L-谷氨酸，并分 别溶解到100 mL蒸馏水中，调节pH5. 5,6。1.3 谷氨酸发酵液预处理谷氨酸发酵液离心，11 400 r/ min，5 min，取上清液弃去菌体，用蒸馏水稀 释100倍，调节pH 5.5,6。1.4 茚三酮试剂的制备称取0.5 g茚三酮溶于100 mL丙酮中。1.5 pH调节试剂的制备?2 mol/ L NaOH 溶液:称取 80 g NaOH 溶于 100 mL 蒸馏水中；?1 mol/ L HCl 溶液:量取36 mL盐酸溶于64 mL蒸馏水中。1.6标准溶液OD值的测定569取20只试管，分别加入3
11、 mL配制好的0. 5,5. 0 g/ 100 mL的L-谷氨酸纯 品溶液各2管。往每只试管中分别沿壁加入0. 5 mL的茚三酮试剂，塞上PVC胶 塞。摇匀管内溶液，迅速按先后置于80 ?水浴锅中加热3 min。快速取出保温到时 的试管，将之插入冰浴锅中，静置3 min。将分光光度计波长调至569 nm处，以 蒸馏水为空白对照，用1 cm石英比色杯比色，测出各浓度标准样品OD值。 5691.7发酵样品的谷氨酸含量测定取3 mL预处理好的发酵液加入15 mmX150 mm玻璃试管中，调整pH 5. 5左 右。沿试管壁加入0. 5 mL茚三酮试剂，塞上PVC胶塞。将试管中液体振匀，迅 速置于80?
12、水浴中加热3 min。快速取出保温到时的试管，插入冰浴锅中，静置3 min。将分光光度计波长调至569 nm处，以100倍稀释的空白液体发酵培养基为 空白对照，用1 cm石英比色杯比色，测出OD值。从标准曲线上查出相应L-569谷氨酸浓度。将从标准曲线上查得的数据乘以稀释倍数即为实际谷氨酸发酵液 中L-谷氨酸浓度值。2、谷氨酸的等电回收2.1 等电回收流程2.1.1测定放罐体积、pH、谷氨酸含量和温度。2.1.2开搅拌，加HCl调节pH至pH3.0,3.2，搅拌育晶20 h，开大冷水降 温，使温度尽可能低。停止搅拌静置沉淀4 h,关闭冷却水，将上层菌体液放至近 谷氨酸层面时，用真空泵将谷氨酸表
13、层菌体和细谷氨酸抽到另一容器里回收。取出 底部谷氨酸，离心甩干，水洗谷氨酸，可改善谷氨酸的质量和色泽。 2.2 操作要 点八、(1) 将放罐的发酵液先测定放罐体积、pH、谷氨酸含量和温度，开搅拌。若放 罐的发酵液温度高，应先将发酵液冷却到25,30?，消除泡沫后再开始调pH。用盐 酸调到pH5.0(视发酵液中的谷氨酸含量高低而定)，此时以前及时加酸速度稍快， 影响也不大;(2) 当pH达到4.5时，应放慢加酸速度，在此期间应注意观察晶核形成的情 况，若观察到有晶核形成，应停止加酸，搅拌育晶2,4 h。若发酵不正常，产酸低 于4,，虽调pH到4.0,仍无晶核出现，遇到这种情况，可适当将pH降至3
14、.5,3.8 左右;(3) 搅拌2 h,以利于晶核形成，或者适当加一点晶种刺激起晶;(4) 搅拌育晶2 h后，继续缓慢加酸，耗时4,6 h,调pH至3.0,3.2，停酸复 查pH，搅拌2 h后开大冷却水降温，使温度尽可能降低；(5) 到等电点pH后，继续搅拌育晶16 h以上，停止搅拌静置沉淀4 h,关闭冷 却水，吸去上层菌液，至近谷氨酸层面时，用真空泵将谷氨酸表层菌体和细谷氨酸 抽到另一容器里回收。取出底部谷氨酸，离心甩干。发酵液加HCl育晶 2 h(pH 4,5)加HCl育晶 2 h(pH 3.8,3.5)加HCl育晶 2 h(pH3.0,3.2)加HCl(维持pH稳定)搅拌育晶 20 h沉淀 4 h母液细谷氨酸
