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1、金黄色葡萄球菌根据其对甲氧西林的耐药性可分为MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)和MSSA(甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌)。自从19世纪60年代发现第一株MRSA以来，MRSA在全球的分离率逐年升高。菌株分型是医院获得性感染的流行病学研究的重要方法之一，在过去的五年里，细菌分型的方法有了突飞猛进的发展，我们就目前常用于MRSA分子分型的技术进行比较。1 SCCmec分型1.1 SCCmec的定义和结构SCCmec是一个可移动的复合体结构，大小从2167 kb不等，可以整个地从染色体中自发剔除，也可从一个菌细胞转移整合到另一个菌细胞染色体中。根据目前的研究结果推测：SCC是一个基因交换的载体，SC
2、Cmec只是SCC家族中携带有mecA 基因的一个特例，?MRSA的产生，是对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(methicillin-suseeptible staphylococcus aureus MSSA)通过SCC从其他菌株中获得mecA的结果，它同样可以使其他抗生素耐药基因在葡萄球菌间传递，这可能是MRSA容易获得多重耐药的根本原因。SCCmec的结构复杂，因外来基因整合数量不同其大小也不同。总体来说，它由两部分组成：第1部分是特征性结构，存在于所有的MRSA中，包括：保守的末端正序重复序列(direct repeat sequence，DR)和(或)反序重复序列(inverted r
3、epeat sequence，IR)、mec操纵子、在mecA基因左右存在的保守的基因结构以及负责SCCmec移动的ccr基因;第2部分是功能未明确或无功能区。1.2 以下是近几年来发展的几种SCCmec分型的PCR方案：1)Boye等人1应用四对引物的多重PCR可以进行MRSA菌株型到型的简单快速分型， 但不能区分亚型，适于实验室快速初筛。2)Zhang等人2多重PCR方法可同时检测、 、 、 a、 b、 c、 d、 8个主要的型和亚型，还扩增mecA基因作为阳性内参。优点是能同时区分8种型和亚型的J1区差别，但是由于只设计了针对a、 b、 c、 d四种亚型的引物，因此不能检出其他型的亚型。
4、3)Oliveira 和 Lencastre3应用的多重PCR方案可同时区分多个位点的差异(如mecA 基因， mecI基因， I型和II 型的J1区，ccrC，dcs(downstream constant sequence)区，pT181，及pUB110)，但只能区分到型，Zhang等人的多重PCR方法由于只能检测大部分型别的单个位点，因此区分能力不如Oliveira 和 Lencastre的方案，以上两种多重PCR方法都将SCCmercury作为鉴定型SCCmec的特异位点，而事实上SCCmercury并不是型SCC元件所特有的，因此在对于区分型的引物的设计方面有一定缺陷，有时会将型鉴定
5、为型。4)Kondo等人4应用六套多重PCR方法可以快速准确的进行SCCmec分型，第一套和第二套多重PCR进行型的确认，第三、四套用于区分基于J1区差别的亚型，第五、六套用于确定J2和J3区耐药决定子，如转座子(Tn554或Tn554)和质粒(pUB110或pT181)。该方法可以区分I到型的多种亚型，但是相比上述几种方法更为繁琐。5)SCCmec型MRSA是主要的社区获得性菌株，Milheirico等人5设计的多重PCR反应针对型SCCmec可以一次区分8种主要的亚型。1.3 SCCmec型别的发现和流行目前至少发现7种主要的型别。第一株MRSA(NCTC10442)是在1960年在英国分
6、离到的，携带型SCCmec，这株菌被认为是MRSA的原始克隆，并在19世纪60年代散播于世界各地;1982年，日本分离出携带型SCCmec的MRSA菌株(N315)，这一克隆被称为是纽约/日本克隆，并很快散播开来;3年后，携带型SCCmec的MRSA菌株(85/2080)在新西兰被发现;从19世纪90年代开始，型SCCmec的MRSA在全世界散播;2004年，在澳大利亚发现了型SCCmec的MRSA菌株(WIS克隆);型菌株只在葡萄牙分离到，原始株为HDE288克隆;型SCCmec(即原来的T型)最初在台湾分离的TSGH-17菌株中发现。型别不同菌株的耐药基因、毒力基因携带情况有所不同。例如：
7、携带I型的菌株为原型株，含耐药基因少，除对-内酰胺类抗生素耐药外对其他抗生素敏感，多重耐药率低;型菌株携带的耐药基因较I型多，耐药基因的数量和种类在不同的地区有区别;型菌株是携带耐药基因数量最多、多重耐药率最高的菌株，耐药谱在不同地区间区别很大;?IV和V型菌株除携带mecA外不带其他耐药基因。2 脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)2.1 PFGE技术原理将细菌包埋于琼脂块中，用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切，酶切片段在特定的电泳系统中通过不断交替变换电场方向及调整合适的脉冲时间而得到良好的分离。MRSA的脉冲场凝胶电泳多采
8、用限制酶(Smal)原位切开DNA基因组，获得大片段(50700kb)的DNA。2.2 结果解释PFGE结果判断采用Tenover等人6引入的标准“03条带不同，为同一型，用1个英文大写字母表示，如A 型;?46条带不同，认为是同一型别的不同亚型，表示方法为A1、A2、A3等;7条或更多带不同为不相关的不同型，用其他的英文字母，如B、C、D型等表示。据此， Tenover等提出的解释标准是：1)相同(indistinguishable)：酶切图谱间有同样的条带数，且相应条带大小相同，流行病学上则认为相同，这种经PFGE证实的结果，用其他方法检测不可能显示实质性的差异。2)紧密相关(closel
9、y related)：其他株与暴发株有一致的单一基因事件的改变，如点突变、插入或DNA缺失。典型的情况下，这种变化可导致23条带的差异，当一些分离菌株被多次重复培养或自同一患者多次分离时可观察到这种现象。3)可能相关(possibly related)：如出现了46条带差异，这些菌株与暴发株间遗传基因并非紧密相关，在长于6个月时间及大范围的暴发中收集的菌株可出现这类情况。4)不相关(unrelated)：1个分离菌株通过3个更多个独立的基因事件所致的改变，其PFGE图谱与暴发株不同，则可认为与暴发株不相关(一般有7个或更多个条带的差异)。2.3 PFGE分型的方法评价脉冲场凝胶电泳是一种适用于
10、大部分细菌分子分型的技术，是分辨率最高的分型方法之一，因此成为研究医院爆发流行MRSA分型的金标准。由于PFGE常采用能识别稀有碱基的限制酶，且是从整个基因组得到的随机样本，所得限制性片段较大，结果较为可靠，具有高分辨率。但PFGE存在局限性，主要在于需特殊仪器，费时太长，且过程繁琐;而且由于没有国际统一的严格标准化的命名方法，使得实验室之间的数据比较成为问题，目前只在少数国家内实现了标准化命名，如荷兰和美国7。3 多位点测序分型(multilocus sequence typing，MLST)3.1 MLST技术原理MLST是Maiden等人8于1998年在多位点酶切电泳技术的基础上为研究菌
11、群基因结构而设计的一种高分辨率分型技术。金黄色葡萄球菌的MLST以看家基因的PCR片段序列多态性分析为基础，比较等位基因谱。7个看家基因包括arcC(编码氨基甲酸酯激酶)、aroE(编码苯草酸脱氢酶)、alpF(编码甘油激酶)、gmk(编码鸟苷酸激酶)、pta(编码磷酸转乙酰酶)、 tpi(编码磷酸丙糖异构酶)和yqiL(编码乙酰辅酶A乙酰转移酶)，其长度分别为456，456， 465，429，474，402、516bp。合成7对引物对这7个基因进行扩增，扩增后产物测序，然后与Internet上EMBL/GenBank数据库中已有序列比较，指定每个基因的等位基因编号，7个基因的等位基因谱就对应
12、了该菌株的序列型别(ST)。例如EMRSA-16克隆的MLST基因谱为2-2-2-2-3-3-2，并被命名为ST36。3.2 快速鉴定MLST型别基于某些流行ST克隆中的特殊位点设计引物应用PCR方法可进行快速筛查。如Feil等人9采用的PCR方法快速检测一种亚洲流行克隆ST239，特异性和准确性较高，适合实验室对流行克隆的大批量初筛。Van Leeuwen等人10报道应用DNA芯片进行快速鉴别MRSA的ST型别，但是这一方法需要不断的更新才能够检出不断发现的新的ST型别。3.3 MLST分型的方法评价MLST的的优点是：重复性好，建立了有大型数据库的国际网站，可直接将试验结果提交数据库进行比
13、较，为全球金黄色葡萄球菌流行病学研究提供巨大的信息资源，并可分析菌株的遗传相关性。此外，该法适合长期大范围的流行病学调查(如全球流行病学调查)，通过分析MLST数据探究菌株的起源和进化。但MLST应用起来也存在一定的限制，如工作量大，费用高，技术要求严格，需特殊仪器设备，不适合暴发流行的常规调查和全球流行病学水平的监督。4 spa分型(金葡菌蛋白A基因多态性分型)4.1 spa分型的原理spa是金黄色葡萄球菌细胞壁的组成部分，spa基因长约2?150 bp，包括Fc结合区、X域和C末端3个区域。X域含2-15个长21-27bp(大多24 bp)的重复序列，该区由于重复序列的数目、特征及排列顺序
14、不同而具高度多态性。spa分型是一种基于spa基因的高度可辨重复序列的单位点序列分型技术，其原理是根据spa基因序列设计引物对X区域进行扩增，将电泳结果与spa重复序列分型数据库中已有型别比较，从而达到分型的目的。spa基因的多态性主要是由于基因点突变以及重复序列的删除和复制所造成的11，X域具有良好的重复性和体内、外稳定性，Frenay等12曾对4株MRSA在体外分别传代10次后，?X域DNA序列无改变;而在一个MRSA携带的囊性纤维化患者中分离到的两株MRSA，虽然分离时间相隔5年，但X域DNA序列无改变。同时spa还能够很好地区分不同的克隆，不同spa基因型的菌株不具有流行相关性，因此可
15、以根据spa基因序列对不同的菌株进行基因分型。4.2 spa分型的方法评价spa基因分型具有快速，准确，区分能力强的优点，spa对菌株的区分能力与PFGE相当，其分辨能力优于多位点序列分型(MLST)13。因为它只涉及spa基因的测序，因此相比MLST而言，费用低，工作量小，时间短。Koreen等人(2004)和Harmsen等人(2003)曾分别提出两套不同的分型命名方案，这为分析已发表的分型数据带来困难14-15，但应用StaphType程序可以克服这一困难，便于实验室间数据比较。目前已建立了spa重复序列和分型的数据库(http：/www.ridom.de/spaserver/)，可以更方便地进行序列比对和分型。这是关于MRSA的最大的分型数据库之一，涵括了近3 900个spa型别，包括来自全世界51个国家60 000多株MRSA的近230种重复序列的组合。spa分型同时还具有结果容易解释，易于标准化和易于不同实验室间的比较等优点，不仅可以用于研究MRSA分子进化，还可用于医院内MRSA暴发流行研究15，根据重复序列数初步区分流行株和非流行株，同时还可以通过数据库了解不同国家和地区的菌株流行情况。在那些MRSA携带地方流行的Spa基因的医疗机构和地区，持续的搜集spa分型数据有助于形成自动检测MRSA暴发流行的早期预警系统，达到控制MRSA的感染的目的16。
