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1、碳青霉烯酶的研究进展碳青霉烯类具有非常广泛的抗菌活性，因能抵抗大多数内酰胺酶的水解，故常用于产超广谱-内酰胺酶（ESBL）和/或去阻遏AmpC-内酰胺酶（AmpC）菌株引起严重感染的治疗但碳青霉烯耐药肠杆菌的出现，给临床治疗带来了极大困难。通常，革兰阴性菌对碳青霉烯类的耐药机制，一是AmpC酶过度表达联合OMP丢失;二是PBP对碳青霉烯类亲和力的改变；三是碳青霉烯酶（Carbapenemases）的产生在这些机制中，最突出的是碳青霉烯酶。一、碳青霉烯酶的分类及有关细菌碳青霉烯酶是指能够明显水解亚胺培南或美罗培南的一类P-2内酰胺酶，包括Ambler分子分类的A、B、D3类酶。A类为丝氨酸酶，其
2、活性部位具有丝氨酸结构，属于Bush分群中的第2f亚组。A类碳青霉烯酶少见，包括阴沟肠杆菌（IM121和NMC2A）、黏质沙雷菌中由染色体介导的NMC2A、Sme21、Sme22、Sme23、IMI21酶,以及肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌中质粒介导的KPC1、GES22酶。这类酶都是青霉素酶,他们对亚胺培南的水解活性强于美罗培南,可以引起青霉素类、氨曲南、碳青霉烯类耐药,而对第3代头孢菌素通常敏感。三唑巴坦、克拉维酸可以抑制此类酶,但不被乙二胺四乙酸（EDTA）所抑制。Amble分类D类为丝氨酸酶,属于Bush分群中的第2d亚组，其活性部位具有丝氨酸结构，由blaOXA等位基因编码，仅见于不动杆
3、菌。Amble分类B类是金属酶，属于Bush分类3组,是一种需金属离子发挥活性的B-内酰胺酶，由blaIMP、blaVIM、blaSPM和blaGIM编码，可被EDTA所抑制，染色体介导或质粒介导,存在于多种不同革兰阳性和革兰阴性细菌中。金属酶均可明显水解亚胺培南,能水解除单环类抗菌药物以外的绝大多数B-内酰胺类抗菌药物，但对于其他B-内酰胺类抗菌药物的水解能力有较大差异。临床使用亚胺培南等碳青霉烯类抗菌药物大大增加，导致金属B-内酰胺酶产生率有不断上升的趋势。目前尚未开发出有效的金属酶抑制剂。二、碳青霉烯酶的研究进展对碳青霉烯酶的研究主要着重于对A、B、D3类酶的种类、分布、生化特性、流行病
4、学等的研究和相关菌株耐药性的研究。（一）A、D类碳青霉烯酶的研究1、A类碳青霉烯酶的研究自从20年多前发现第一个A类碳青霉烯酶以来，至今已发现6群不同的酶，包括GES、KPC、SME、IMI/NMC-A、SHV-38和SFC-1,其中GES、KPC和IMI-2由质粒编码，其他均由染色体介导依据Bush-J-M分类系统，这些酶分为4个不同的表型亚群，即2br、2be、2e和2f亚群。与其他A类-内酰胺酶一样，A类碳青霉烯酶利用活性位点丝氨酸残基灭活-内酰胺类药物，可水解青霉素类、头孢菌素类、单酰胺类和碳青霉烯类，这种活性可被克拉维酸和他唑巴坦所抑制，但对EDTA不敏感。成熟A类碳青霉烯酶是单体酶
5、，含有265269个氨基酸残基，分子量为2532kDa，pI为5.89.7。与其他丝氨酸酶一样，A类碳青霉烯酶也通过3步催化机制(包括酰化和脱酰基)来发挥作用。与D类和B类碳青霉烯酶一样，对美罗培南的水解率低于亚胺培南，但对美罗培南的亲和力却始终高于亚胺培南。尽管A类碳青霉烯酶群体中的氨基酸序列一致性较低，但却具有能使它们水解碳青霉烯类的相似的蛋白折叠(Proteinfolds)。除SHV-38以外，A类碳青霉烯酶的一个共同特征，是在Cys69和Cys238之间均含有一个二硫键，这个键可以稳定蛋白折叠。二硫键是水解所有-内酰胺类所必需的，并非仅针对碳青霉烯类的水解，它是稳定酶结构的一种需要。目
6、前，产A类碳青霉烯酶菌株感染仍较少见，大多为零星出现SME、IMI/NMC-A和SFC-1均由染色体编码，尽管对碳青霉烯类表现为高水平耐药，但对超广谱头孢菌素仍保持敏感，因此，目前尚未引起广泛的临床问题。令人担忧的是KPC和GES酶的出现与扩散。2、D类碳青霉烯酶的研究1993年，PATON等报道的第一个具有碳青霉烯酶活性的B-2内酰胺酶,纯化于1985年分离于苏格兰爱丁堡病人的多重耐药鲍曼不动杆菌，命名为AR121。直到2000年，DONALD等对AR121酶的氨基酸进行序列分析，将其命名为0XA223o20002004年之间，在世界各地又发现了6种新的D类碳青霉烯酶。随后又在许多国家碳青霉
7、烯类耐药菌株中发现了7种D类酶。迄今为止，在121种OXA型酶种，至少有45种具有碳青霉烯酶活性。成熟D类碳青霉烯酶含有243260个氨基酸残基,分子量为2335.5kDa不等，pI为5.19.0。该类酶对亚胺培南的水解速率是青霉素的1%3%,对苯唑西林的水解速率是青霉素的2倍,对三代头孢菌素的水解活性很弱;其活性可被他唑巴坦和克拉维酸所抑制。对携带编码D类碳青霉烯酶重组质粒的大肠埃希菌转化结合子或转化株的体外抗生素敏感性研究发现,它们对氨基青霉素和羧基青霉素高水平耐药,对脲酰基青霉素的敏感性不定（仅OXA240和OXA248对哌拉西林耐药）;对头孢菌素类,包括窄谱头孢菌素、氧亚氨基头抱菌素和
8、72a2甲氧基头抱菌素、氧头抱烯类以及单酰胺类均敏感（仅OXA248对头孢噻吩耐药）o除了OXA223显示哌拉西林在他唑巴坦存在下其MIC值降低8倍以外，其他对克拉维酸和他唑巴坦的抑制作用不敏感。通常,D类碳青霉烯酶表现出弱碳青霉烯水解活性,产该类酶的分离菌对碳青霉烯类的耐药,可能是同时伴有其他耐药机制的结果，如外膜孔蛋白丢失、泵出作用增强、青霉素结合蛋白（PBP）改变等。产D类碳青霉烯酶（OXA251除外）均显示对亚胺培南和美罗培南的高水平（MIC8mg/L）耐药,但在大肠埃希菌中仅表现为敏感性减低(MICW2mg/L),有力证明了其他耐药机制的存在。POIREL等报道的产0XA248的肺炎
9、克雷伯菌对碳青霉烯类高水平耐药(MIC=64mg/L)，可能是由于该菌株blaOXA248基因与IS1999联合导致OXA248的过度产生、以及36kDa孔蛋白缺乏所致。产OXA224的鲍曼不动杆菌中,由于2种外膜孔蛋白(22kD和33kD)表达减低限制了外膜通透性，从而导致了对亚胺培南和美罗培南的高度耐药(其MIC分别为128和256mg/L)。而产生OXA223和OXA258的鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类的高水平(MIC$32mg/L)耐药，可能是D类碳青霉烯酶的高度表达与泵出作用增强的结果。此外，产D类碳青霉烯酶的鲍曼不动杆菌也可对非B2内酰胺类抗生素耐药,如氨基糖苷类、氟喹诺酮类、磺胺类、
10、氯霉素和四环素等。D类碳青霉烯酶主要分布于临床分离的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌，以OXA223最为流行，其次是OXA258和OXA24O。1998年以来,产OXA223不动杆菌引起的医院暴发感染见于世界各地,如巴西、英国、塔希提岛等。韩国某医院产OXA223鲍曼不动杆菌的暴发感染持续了8个月,涉及36例病人。在我国,李蓉等报道了南昌鲍曼不动杆菌流行株80%携带OXA223基因。王辉等报道,在收集的来自19992005年我国不同地区11家教学医院的221株亚胺培南耐药不动杆菌中,97.7%的菌株含有OXA223样基因,说明OXA223在我国广泛分布。DASILVA等则报道了19982003年分离
11、于3家葡萄牙大学医院162株亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌,所有菌株具有类似的多重耐药模式，包括亚胺培南耐药(MIC32mg/L)。结果显示，多重耐药鲍曼不动杆菌流行克隆携带blaOXA240,表明OXA240在葡萄牙存在持续流行。2005年,LO2LANS等报道了产OXA240鲍曼不动杆菌在美国芝加哥多个城市引起的暴发感染,100株鲍曼不动杆菌中,97%均归于1个克隆,说明在该地区为鲍曼不动杆菌的单克隆传播。实验已经证明,细菌产生针对某一底物的低水平活性酶,当这个底物存在时可能促进这个酶更有效。从广谱酶进化到超广谱酶、耐酶抑制剂酶或碳青霉烯酶的现象在产SHV酶的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌中已经得到
12、证实。因此,可以预言,碳青霉烯类抗生素的广泛应用可能导致铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌产生更有效的水解酶,其前景另人担忧。(二)相关菌株耐药性的研究1、鲍曼不动杆菌耐药性及碳青霉烯酶的研究鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii,A.Baumannii)是重要的医院感染病原菌,在发生于下呼吸道医院感染的革兰阴性病原菌中,其仅次于大肠埃希菌和铜绿假单胞菌,居第三位。其耐药率逐年上升,出现了泛耐和全耐菌株,世界各地均有多重耐药A.Baumannii导致医院感染流行的报道。在综合性医院的ICU及移植病房，常常因为多重耐药A.Baumannii感染导致最终的治疗失败。鲍曼不动杆菌对碳青霉
13、烯类耐药机制主要包括通透性降低、流出泵过度表达、碳青霉烯酶的产生。其中OXA型碳青霉烯酶是引起世界范围鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的最重要原因。目前实验研究显示鲍曼不动杆菌对亚胺培南、美罗培南、头孢哌酮/舒巴坦较为敏感,对其他抗菌药物耐药情况严重;对耐碳青霉烯类药物的菌株多重耐药性尤其显著,临床应加强检测和监测。主要方法为PCR检测及基因序列分析。魏艳艳对2005年安徽省部分医院(18家)临床分离的鲍曼不动杆菌的耐药性进行了研究。结果显示鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药率最低(6.4%)、其次为美罗培南(20.5%)和头孢哌酮/舒巴坦(29.7%),对四环素的耐药率最高(81.5%);其余抗菌
14、药物耐药率均在50%左右或以上。采用聚合酶链反应扩增IMP、VIM、OXA型碳青霉烯酶基因并测序并采用ERIC-PCR方法进行产酶菌株的同源性检测显示安徽省18家医院分离出的耐亚胺培南和/或美罗培南鲍曼不动杆菌主要产OXA-24型和IMP型碳青酶烯酶，部分菌株同时产2种或以上碳青霉烯酶,且少数产酶菌株间存在克隆传播现象。冯红军等对在平顶山市第一人民医院收集到的亚胺培南耐菌株进行耐药性分析,并对碳青霉烯酶基因进行了检测。217株鲍曼不动杆菌中头孢哌酮/舒巴坦耐药率最低,其次是亚胺培南,再者是头抱他啶和哌拉西林/他唑巴坦。产OXA223型B2内酰胺酶是鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药的重要原因。周敏等的
15、研究也显示携带OXA-23型碳青霉烯酶基因的鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药的耐药率高其编码基因为blaOXA-23。另外，胡源等的研究表明碳青霉烯酶基因PCR扩增用于检测鲍曼不动杆菌特异性较高,但如果仅从扩增片段长度判断,存在出现假阴性的可能。在国外，Heritier等通过质粒转导的试验证实Ade-ABC外排泵系统的过度表达联合OXA酶的表达可以共同导致较高水平的耐药可以推断临床中产碳青霉烯酶的不动杆菌对多种药物的多重耐药可能是由多种碳青霉烯酶共同作用并联合其他机制，例如药物靶位结合蛋白的变异导致与药物亲和力降低、细菌外膜蛋白通透性降低等所导致的高水平耐药，各种耐药机制之间的协同关系仍需进一步研
16、究。2、对肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的研究进展肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiellapneumoniaecarbapenemase,KPC酶)最早在一株亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌中被发现。从2000年以后,KPC酶家族陆续在美国的新英格兰和亚特兰大地区被发现,主要在克雷伯菌属中,也在其他菌株中被发现。由于肠杆菌是临床上重要的医院感染菌,其对碳青霉烯类抗菌药物的耐药给临床抗感染治疗带来了极大困难。在我国，2008年冯雅君等收集浙江大学医学院附属第一医院2006年3月至9月住院患者连续分离、不重复的对碳青霉烯类抗生素敏感性下降的肺炎克雷伯菌10株，采用Etest法、电聚焦电泳(IEF)、聚合酶链反应(PCR)及序列分析、接合试验等分析得到10株菌株对p一内酰胺类抗生素呈多重耐药，但对多黏菌素.替加环素，复方SMz敏。质粒介导的KPC一2造成肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素敏感性下降.并短暂流
