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1、描述：目的 观察神经导向因子Slit2及Robo4在肺组织的表达并探讨二者在ALI发病中的作用。方法 在南华大学实验动物部将48只SD雄性大鼠随机（随机数字法）分为对照组（n=24）与ALI组（n=24）。.【摘要】目的观察神经导向因子Slit2及Robo4在肺组织的表达并探讨二者在ALI发病中的作用。方法在南华大学实验动物部将48只SD雄性大鼠随机（随机数字法）分为对照组（n=24）与ALI组（n=24）。ALI组采用盲肠结扎穿孔术复制急性肺损伤模型，对照组只开腹关腹，不行盲肠结扎穿孔术，以血清炎症因子浓度、动脉血氧分压（PaO2）、组织水肿、肺部特征性病理改变作为ALI模型成功主要指标。两
2、组又分为术后12、24、48h3个组，每组8只。取大鼠动脉血测定PaO2；取肺组织测定湿/干质量（W/D）比值，并观察肺毛细血管通透性及组织病理学改变；ELISA检测血清TNF-水平；RT-PCR测定肺组织Slit2及Robo4mRNA表达，免疫组织化学法观察蛋白表达情况。采用SPSS13.0统计软件行单因素方差分析，P0.05为差异具有统计学意义。结果与对照组比较，ALI组致伤后各时间点PaO2均降低，肺W/D比值、肺毛细血管通透性、血清TNF-水平均升高（P0.05），病理观察显示肺组织受损；RT-PCR结果显示ALI组12h，24h，48h肺组织Slit2mRNA表达量较同期对照组下降（
3、0.560.13）vs.（0.870.05），F=41.39，P0.05，（0.420.10）vs.（0.850.07），F=93.54P0.05，（0.260.08）vs.（0.890.09），F=227.05，P0.05，（0.820.05）vs.（0.890.08），F=2.061，P0.05，（0.850.08）vs.（0.860.05），F=0.035，P0.05；免疫组织化学研究显示Slit2主要表达于内皮细胞膜上，亦可表达于肺上皮细胞胞核及胞浆，Robo4则只表达于内皮细胞膜上；ALI组3个时间点肺组织Slit2蛋白表达量较同期对照组下降（0.370.05）vs.（0.450.0
4、7），F=6.82，P0.05，（0.320.06）vs.（0.470.09），F=23.54，P0.05，（0.280.07）vs.（0.460.06），F=28.01，P0.05，（0.530.09）vs.（0.500.05），F=0.498，P0.05，（0.550.06）vs.（0.560.07），F=0.073，P0.05。结论对照组大鼠肺组织可表达Slit2及Robo4，盲肠结扎穿孔致ALI大鼠肺组织Slit2表达下降，这可能与ALI发病有关。临床上脓毒症作为ALI/急性呼吸窘迫综合征（acuterespiratorydistresssyndrome，ARDS）的间接诱因，常可伴发
5、ALI/ARDS。随着肺保护性通气策略的推广，ALI的病死率已趋下降，但仍高达30%40%。MacSweeney等研究发现，在早期对ALI进行积极治疗，能够有效阻断MODS中各器官衰竭的序贯进行，从而提高危重症患者的治愈率。以往对于ALI发病机制的研究集中在“瀑布样”炎症反应导致肺上皮细胞及血管内皮细胞受损。分泌性糖蛋白Slit与其配体Robo最初只被定义为神经导向因子中的一员，2010年，Lee和Slutsky研究发现Slit2/Robo4信号通路与白细胞的迁移、血管的生成及维持内皮功能的稳定有一定的关系，但对Slit2及Robo4在急性肺损伤发病机制中的作用方面的研究尚不多。本研究通过观察
6、ALI大鼠肺组织神经导向因子Slit2及Robo4的表达，探讨二者在脓毒症ALI发生、发展中的作用。1材料与方法1.1主要材料清洁级雄性SD大鼠48只，体质量（25020）g，购自南华大学实验动物部。TNF-、IL-6（ELISA）试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；伊文思蓝（大连美仑生物科技有限公司）。Trizol（美国Invitrogen公司），cDNA逆转录试剂盒（美国fermentas公司），内参照-actin，Slit2和Robo4的特异性引物（上海桑尼生物科技有限公司），兔抗大鼠Slit2多克隆抗体及兔抗大鼠Robo4多克隆抗体（北京博奥森生物有限公司）。PCR扩增仪（美国Axy
7、gen公司）。血气分析仪（瑞士Roche公司OPTICCA型）。1.2动物分组48只SD大鼠按随机数字表法分为对照组24只和ALI组24只。参照Rittirsh等5报道的盲肠结扎穿孔术（cecumligationandpuncture，CLP）复制脓毒症ALI模型。动物以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，无菌条件下，取正中切口开腹，将盲肠移出腹腔，在其根部结扎，用18号针贯穿2次，挤出少量肠内容物，留置2cm皮瓣防止针孔闭合，还纳盲肠于腹腔，缝合切口，置笼内活动，不禁饮食。对照组只开腹、关腹，不行盲肠结扎穿孔。每组又分为术后12、24、48h3个时间点组，每组8只大鼠。ALI造模成功标准如下：有肺
8、上皮细胞及肺血管内皮细胞损伤的证据（血液、肺支气管灌洗液或肺组织局部有相应的细胞应子或酶的变化）；病理切片上轻度肺水肿，或仅有间质性水肿，无透明膜形成；有肺血管通透性升高的证据；氧分压下降，同时满足4点即判定为负荷急性肺损伤模型。本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准。1.3检测指标及方法两组按不同时间点采颈动脉血0.5mL，采用血气分析仪测定动脉血氧分压（PaO2）。各观察时间点分别取各组大鼠8只，用10%水合氯醛（3mL/100g）腹腔注射麻醉，开胸经心脏取血，置于不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，3000r/min离心10min将血清和红细胞迅速小心地分离，即得血清，于
9、-80超低温冰箱保存。取右下肺组织用于测定肺湿干质量比（W/D），左下肺组织测定伊文思蓝含量，留取适量肺组织，置于1.5mLEP管中，并放适量RNA保存液，右肺组织用4%多聚甲醛溶液固定，用于石蜡包埋、备做HE染色及免疫组化。1.3.1大鼠血清TNF-质量浓度检测严格按试剂盒操作说明书进行，选择450nm波长进行检测，确定标准品和空白对照区域，由酶标检测仪自动检测计算并绘制标准曲线，计算检测结果。1.3.2肺毛细血管通透性检测两组大鼠于麻醉后处死前30min经尾静脉注射伊文思蓝，水合氯醛腹腔注射后开胸心脏取血，立即处死并取少量左下肺，将肺组织浸泡于甲酰胺溶液，37恒温箱中温浴48h，待组织中色
10、素浸出，取出肺组织，离心10min后取上清液，用分光光度计（波长620nm）比色，根据标准曲线计算伊文思蓝的含量，以此反映肺血管壁通透性改变。1.3.3肺W/D比值测定将右下肺组织称质量（湿质量）后置于70烘箱内，真空条件下烘烤48h称干质量，计算肺W/D比值。1.3.4肺组织病理观察取右上肺组织置4%多聚甲醛溶液中，依次进行脱水、石蜡包埋、制成切片，苏木精-伊红（HE）染色后光镜检查。1.3.4医教论文RT-PCR检测肺组织Slit2及Robo4mRNA表达取右肺冷冻组织100mg，按Trizol法常规提取组织总RNA，反转录合成cDNA，行逆转录PCR扩增，引物序列及扩增长度见表1。Sli
11、t2反应条件：955min，9430s，5830s，721min，共38个循环。Robo4反应条件：955min，9430s，6530s，721min，共35个循环。内参-actin反应条件：955min，9430s，5630s，721min，共32个循环。以Slit2mRNA及Robo4mRNACt值分别与相应内参照基因-actinCt值的差值标化表示各项目的即应的表达量。1.3.5肺组织中Slit2及Robo4免疫组化观察采用过氧化物酶标记的链霉卵白素法（SP法），将肺组织石蜡包埋、切片，常规脱蜡，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗，3%H2O2溶液消除内源性过氧化物酶，胰蛋白酶修复后，正常兔血清
12、封闭非特异性抗原，各自滴加1500羊抗大鼠Slit2抗体及1500羊抗大鼠Robo4抗体，2过夜。PBS漂洗后滴加辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗，37孵育30minPBS漂洗后3，3-二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染，脱水、透明、封片，光镜下观察，以细胞核呈棕黄色染色为阳性细胞。将免疫组化染色结果进行显微照相后，每张切片随机选取5个视野，采用图像分析系统检测出每个视野的A值和面积，得出其单位面积的平均A值，作为该样本的染色强度。1.4统计学方法使用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料以均数标准差（xs）表示，采用单因素方差分析，以P0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1PaO2
13、、肺毛细血管通透性、肺W/D比、血清TNF-质量浓度与对照组相比，ALI组PaO2在术后12、24、48h均降低（P0.05），以48h降低最明显。ALI组3个时间点肺毛细血管通透性均高于对照组组（P0.05）。ALI组3个时间点肺W/D质量比值均高于对照组（P0.05），随着时间推移，比值逐渐上升，3个时间点以48h升高最明显。ALI组各时间点血清TNF-水平较对照组升高（P0.05），3个时间点，以ALI组24h升高最为显著（表2）。2.2肺组织病理学观察对照组大鼠肺泡大小均匀，结构完整，肺泡上皮细胞形态正常，肺泡间隔未见增宽，微血管无充血和淤血，肺间质间隙未见出血、水肿及炎性细胞浸润。A
14、LI组可见：肺组织血管充血，血管周围间质水肿及密集的炎细胞浸润，肺泡隔水肿，肺泡腔内大量渗出，肺泡壁显著增厚，部分肺部上皮细胞变性、肿胀、脱落、间质灶性出血，肺泡腔变小，局限性肺不张（图1）。2.3Slit2mRNA、Robo4mRNA表达变化ALI组大鼠各时间点肺组织Slit2mRNA表达水平与对照组大鼠相比表达明显降低，差异具有统计学意义（P0.05）（图1，图3）。2.4肺组织Slit2及Robo4免疫组化观察对照组均可见Slit2及Robo4蛋白表达，Slit2主要表达于内皮细胞膜上，亦可表达于肺上皮细胞胞核及胞浆，Robo4则只表达于内皮细胞膜上。ALI组大鼠各时间点肺组织Slit2蛋白阳性染色表达部位无改变，随CLP术后时间的延长，肺组织Slit2蛋白表达水平呈逐渐下降趋势，两组差异有统计学意义（P0.05）。见表3，图
