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1、实习1) 学习植物组织培养技术教学目标1知识方面(1)理解植物组织培养技术的基本原理、目的要求和方法步骤。(2)初步掌握植物组织培养的操作技能。2态度观念方面对学生进行科学方法的训练及科学素质的培养。3能力方面(1)培养学生的动手、观察、实验及分析问题、解决问题的能力。(2)培养学生的创新实践能力。实习原理植物细胞具有全能性。在无菌条件下，把植物体的器官或组织片段切下来，接种在适当的人工培养基上进行离体培养，这些器官或组织的细胞就会经过脱分化和再分化的过程，逐渐产生出植物的各种组织和器官，进而发育成一棵完整的植株。用于离体培养的植物器官或组织片段，叫外植体。 在人工合成的培养基中，包含有植物生
2、长和发育所需要的全部营养成分，包括矿质元素(分为大量元素和微量元素)、蔗糖、维生素、植物激素和有机添加物。培养基中的大量元素有氮、磷、钾、钙、硫、镁等。氮是蛋白质的重要组成成分，对离体组织的营养至关重要。其他大量元素也是离体组织正常生长所必需的。培养基中的微量元素有铁、铜、锌、锰、钼、硼、碘、钴、氯、钠等，如果缺少了这些微量元素，植物就会生长不良。培养基中的蔗糖是离体组织赖以生长的重要营养成分。维生素能够明显促进离体组织的生长。植物激素如生长素和细胞分裂素等，是植物细胞脱分化和再分化必不可少的调节物质。有机添加物如甘氨酸等对植物细胞和组织的分化有一定的促进作用，琼脂使培养基呈固体状态，有利于外
3、植体的生长。植物组织培养的方法步骤在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有全面的了解。这主要有三个方面的准备：实验室设计、基本设备及操作技术。 一、实验室设计：实验室由三部分组成：准备室(培养器皿的清洗；培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌)、无菌室(无菌操作材料的表面灭菌和接种)、培养室(放置培养物)。 二、基本设备：准备室的主要设备及用具(电冰箱、高压灭菌锅、电炉、不锈钢锅、水槽、大桌子、玻璃橱、搁架、精密pH试纸、托盘天平、培养器皿、分装培养基的器具、试剂瓶、移液管、量简、烧杯、容量瓶、各式洗瓶刷、胶手套和线手套、大型塑料篮)；无菌操作室的主要设备及用具(超净台
4、或接种箱、小搁架、医用小平车、无菌操作用的器具、烧杯或广口瓶、玻璃棒、常备的消毒灭菌药剂，毛刷、无菌水)；培养室的主要设备及用具(培养架与灯光、配电板、控温仪、温度湿度计)。 三、操作技术：有了良好的实验室和基本设备之后，就应当学习组织培养的操作技术，并在实际工作中经过反复练习而熟练掌握。 1洗涤。 植物组织培养最重要的，也是最基本的要求，就是各项操作都应从无毒害、无污染的培养环境来考虑。培养过程中最经常最大量的工作之一，是洗涤培养瓶及其他常用器皿。最常用的洗涤助剂就是家庭用的洗衣粉及肥皂两种，备一点去污粉也有些用处。洗好的瓶子应透明锃亮，内外壁水膜均一，不挂水珠，即表示无污迹存在。 2灭菌。
5、 灭菌工作是极其重要的。初学植物组织培养技术的人，首先要建立有菌和无菌的概念，即必须明确无误地认识和了解哪些东西是有菌的，哪些东西及其一部分是无菌的，否则工作中出了问题，也不知道毛病出在哪一个环节上。 有菌的范畴：凡是暴露在(未经处理的)空气中的物体，曾经接触过自然水源的物体，至少它的表面，毫无例外都是有菌的。它的内部在未经证实之前，也应以有菌物体看待。 无菌的范畴：经过高温灼烧或蒸煮过后的物体，经其他物理或化学灭菌方法处理过后的物体，是无菌的。 常用的灭菌方法可分为物理方法和化学方法两大类。物理方法如干热(烘烤和灼烧)、湿热(蒸煮或加压蒸煮)、射线处理、微波处理、清洗和大量无菌水冲洗等技术措
6、施。化学方法如使用灭菌剂升汞、福尔马林、双氧水、来苏水、高锰酸钾、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精等等。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料、不同目的适当选用。 (1)培养基的灭菌 培养基在制备过程中带有各种杂菌，分装后应立即灭菌，至少应在24h之内完成灭菌工序。新制备分装好的培养基，常规方法是放人高压灭菌锅内加热灭菌。 (2)不耐热的物质将采用过滤灭菌 一些生长因子，如玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理。通常采用过滤灭菌方法。 (3)玻璃器皿及耐热用具等可采用干热灭菌 干热灭菌是利用烘箱加热到160180的温度来杀灭微生物。由于干热灭菌能源消耗大，费时间，这一方法并
7、不常用，尽可能用高压灭菌来取代它。如进行快速繁殖可以完全不用干热灭菌法。 (4)用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌 在准备做无菌操作时，把解剖刀、镊子、剪刀等浸入质量分数为95酒精中。用之前取出，在酒精灯焰上灼烧灭菌，然后架放在灭过菌的支架上，放凉后立即使用。通常刀、镊子等都准备两把，轮流灼烧使用。， (5)布制品采用高压灭菌 如布(线)手套、帽子、套袖、工作服、口罩等，洗净晾干，用牛皮纸包好，再装人牛皮纸口袋中，经高压灭菌2030min(11kgcm)后取出放置无菌室备用。 (6)其他 桌面、乳胶手套、墙面等可用质量分数为70的酒精反复涂擦作表面灭菌。无菌室内应定期用质量分数为70的酒精或质量分
8、数为05的苯酚喷雾降尘和消毒；用福尔马林(质量分数为40的甲醛)加少量高锰酸钾定期密闭熏蒸，配合紫外线灭菌灯(每次开启15min以上)等等消毒灭菌手段，以使无菌室经常保持高度的无菌状态。 (7)植物材料的表面灭菌 采来用于培养的植物材料，都必须经过仔细的表面灭菌处理。把处理好的材料经无菌操作手续放置到培养基上，这一过程叫做接种，接种的植物材料叫外植体。刷洗、冲洗是材料处理的第一步。第二步是用洗衣粉水或肥皂水浸洗并搅动，这是进一步减少污染的处理。第三步是材料的表面灭菌，要在超净台或接种箱内操作。操作者用肥皂洗手至肘部，用洁净毛巾擦干，用70酒精棉擦手。植物材料的表面灭菌剂已有几种，在不同的情况下
9、选用其中一二种即可(见表1-1)。例如次氯酸钠或次氯酸钙在大多数情况下都能获得令人满意的灭菌效果。如用质量分数为0306的次氯酸钠溶液，灭菌1530min，对许多植物组织效果都很好。 3无菌操作。 (1)将初步洗涤及切割好的植物材料放人广口瓶或带螺旋盖的瓶中，置超净台上，看好时间并记录，倒人加有表面活性剂的灭菌溶液，盖上瓶盖，并轻摇数次。预定时间到了，开盖倒出灭菌液(倒入预备的大烧杯中)。 (2)立即倒人无菌水，盖盖，轻摇，23min后将水倒去，再加适当量无菌水，反复涮洗34次或810次。最后淋去水分，用灼烧放凉的镊子将灭好菌的材料放置在灭过菌的纱布上。 (3)通常小纱包放在灭过菌的小白瓷碟上
10、，上面再放材料。然后一手拿解剖刀，一手拿镊子，使材料在纱布上吸干，并进行适当的切割，有时材料也可在灭菌前全部切好。注意刀和镊子每使用片刻就应擦干净放人质量分数为95的酒精中，并灼烧放凉备用。 (4)外植体植入培养基表面用上述灼烧消毒过的器械，将切割好的外植体插植到培养基表面上。 4培养容器封口物的种类及制作。 棉塞是最早使用，并一直延续至今仍广泛用于植物组织培养和微生物培养的封口物。也可用几层硫酸纸或其他纸包扎瓶口的作法，也有用耐高温塑料薄膜的。如使用棉塞则需预先制作，材料有棉花、纱布和线。先将纱布按需用大小裁好，放在要塞的瓶口上，扯一片棉花放在纱布上，用十字螺刀把棉花向瓶口中压紧，左手把住纱
11、布四角不使压人太深，视瓶、管的大小，一般应有24cm塞人的长度，并不断添加成片的棉花，不断压紧，最后在瓶口上方留一个椭球形的棉团，将纱布四角包好，再用线扎紧，剪去纱布尖角即可。要求棉塞松紧适度，棉球膨大部分能压住瓶口，拔出棉塞时有响声，只提棉塞能吊起瓶子和里面的培养基(太松就不行)。棉塞可使用多年。 5培养基的制备。 (1)贮备液的配制与保存 在组织培养工作中，配制培养基是日常工作，为简便起见，将配方中的药品一次称量供一段时间使用，即配一些浓溶液，用时稀释，这种浓溶液就是贮备液或母液。下面以MS培养基为例，制取贮备液(表11)，一般应按表列顺序依次称量，分别溶解在少量蒸馏水中，最后再依次加到一
12、起，并定容到规定的体积。按表11配制完，再做MS培养基就非常方便了。 (2)培养基的配制 先在洁净的不锈钢锅里放人约750ml蒸馏水，加入所需要的琼脂和糖，最好能在水浴锅里将琼脂溶化，如果直接加热应不停地搅拌，防止在锅底烧焦或沸腾溢出。加入表11中的贮备液工50mL，贮备液、各5mL，按需要加入植物激素和其他打算加人的物质。加入蒸馏水将最终体积调整到1L。充分混合好以后，用KOH(或NaOH)调整pH到所需值(借助精密pH试纸或酸度计)。人趁热将培养基分注到瓶子或试管中，按容器的大小和培养要求放人适量的培养基。加棉塞和包包头纸或包扎其他覆盖物。高压灭菌后取出，放至室温即可使用。表11 MS培养
13、基贮备液的配制成分用量（mg/L）每升培养基取用量（mL）储备液（大量元素）NH4NO3KNO3CaCl22H2OMgSO4.7H2OKH2PO4330003800088007400340050储备液（微量元素）KIH3BO3MnSO4.4H2OZnSO47H2ONa2Mo4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2O16612404460172050555储备液（铁盐）FeSO4.7H2ONa2.EDTA.2H2O556074605储备液(有机成分)肌醇烟醇盐酸吡哆醇盐酸硫胺素甘氨酸200001001002040056、培养 随时注意观察和记录培养物的情况。离体组织经脱分化后可形成愈伤
14、组织（见图片），愈伤组织经再分化后可形成组培苗（见图片）课时安排用一课时集中介绍和演示植物组织培养的操作技术，课下分组进行操作。设计思路（一） 课前铺垫，激励参与。 课前教师组织学生参观课外小组同学培养出来的组培苗，以此来激励大家的参与意识，让每个同学都感觉到植物组织培养技术并不是高不可攀的，只要大家认真参与，努力实习，就会取得成功。（二） 学习植物组织培养的操作技术。教师利用课上时间讲解操作步骤并由课外小组同学演示某些步骤。（三） 由教师分组或自由结组，以小组为单位进行培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌及外植体灭菌和接种、培养。（四） 组织学生进行观察和记录。实习过程：教师活动： (1)实验
15、室的设计、基本设备的购置及操作技术的熟练掌握。 (2)成立课外小组，进行植物组织培养，努力培养出愈伤组织和组培苗。 (3)组织学生参观组培室和组培苗， (4)课上讲解植物组织培养的方法步骤，并由课外小组的同学给大家演示外植体消毒、接种、棉塞制作等步骤。 (5)分小组进行培养基的制备。(课下进行) (6)组织好学生进行外植体消毒和接种。 (7)安排好培养和观察。学生活动：参观课外小组同学培育的组培苗；学习植物组织培养技术；听取课外小组同学介绍植物组织培养的过程并观看接种等过程；在教师及课外小组同学的指导下进行培养基的配制和所用器材的消毒工作；各小组进行外植体消毒、接种过程；培养时定期进行观察；培育出愈伤组织后可在教师的指导下进行组培苗的培育。要点提示 选用什么培养基，先做什么植物的组织培养教师要给出学生建议。
