《核酸细胞化学.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核酸细胞化学.doc（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Feulgen反应原理介绍自从1924年Feulgen等人建立了DNA-Feulgen染色方法以来,至今这种方法仍是DNA定量测定的主要染色方法之一.Feulgen染色是经典显示去氧核糖核酸的方法,该法要求用Carnay氏液固定的新鲜组织效果最好,酒精-甲醛液次之,单纯甲醛固定欠佳,效果不满意.自Feulgen等发明该显示DNA的Feulgen反应法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已取得一致意见。其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红
2、色。也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。2HCl+Na2S2O52NaCl+SO2+H2SO3DNA是主要的遗传物质，集中于染色体上。1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验，鉴定了染色体上DNA的存在，故称为孚尔根染色法。孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关，此试剂的基本成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。碱性品红原为桃红色，当与亚硫酸作用时被氧化，使醌型变为苯型，由桃红色变为无色透明的N-亚磺酸亚硫酸副品红碱，当它与醛基作用时，其
3、分子式又恢复为醌型结构，呈现紫红色利用1M HCl 、60下水解时，可将DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖C-1位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此利用孚尔根反应，可以鉴定DNA的存在。并广泛应用于核及染色体的研究中。Feulgen反应步骤标本需经固定后方可染色，Carnoy固定液可按无水乙醇：三氯甲烷：冰醋酸为6：3：1比例配制。固定后石蜡切片即可。尽量不用新鲜组织恒冷箱切片，因胞质中存在的缩醛磷脂会出现非特异染色。若必须使用恒冷箱切片，需做切片后固定。用已固定的组织石蜡切片可消除缩醛磷脂。减少非特异染色，
4、具体操作如下：1切片脱蜡入水；2用lmol/L HCl浸洗；3切片放人预热到601mol/LHCi内6分钟，(固定的标本为1015分钟Susa固定的标本为18分钟，水解时间因固定液不同而有差异)；4入室温lmol/LHCl洗；5蒸馏水洗；6人Schiff液，于室温暗处(或外包黑纸)3060分钟；7人亚硫酸钠水溶液漂洗3次，每次12分钟；亚硫酸钠水溶液配法：10%NaHS03 5ml1mol/L HCl 5ml加蒸馏水至 100ml8蒸馏水洗；9脱水、透明、封固。结果：细胞核内DNA染成紫红色对照实验：虽然Feulgen法是DNA 的特异染色方法，但如果延长水解时间并在室温下进行反应， Schi
5、ff试剂也与醛、酮、醇和缩醛磷脂起反应，因此用Feulgen法检测DNA时必须严格控制盐酸水解的时间和温度。为减少假阳性和非特异性染色必须做对照实验。可按上述步骤做平行对照实验，仅将第3步，即60 lmol/LHCl水解改为室温15分钟，其余与上述步骤相同，结果DNA应为Feulgen阴性反应。Feulgen反应图大鼠肾小体和肾小管细胞核呈nigert阳性反应，含紫红色反应产物Feulgen方法应注意的问题对照切片的制做进行Feulgen反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放在schiff剂内，且应为负反应。但需要注意的是，对照切片在schiff试剂中最多不要超
6、过1 h (0.5 h即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假的正反应。固定剂的选择以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一性并没有影响。实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于Feulgen反应。如Bhampy固定剂、Helly固定剂、Flemming固定剂、OsO4固定剂、Carnoy固定剂、zenker固定剂和Bouin-Aller固定剂。但在上述固定剂中，以OsO4和Carnoy效果较好，OsO4(1%或0.5%)是Feulgen反应的理想固定剂，只是因OsO4价钱较贵，故一般多采用Carnoy固定液。在Feul
7、gen反应中，不能单独使用Bouin定液，因为它是Feulgen反应的最坏固定剂，但经Aller改进后的Bouin-Aller固定液效果却较好。水解时间Feulgen反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够, 反应就会变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的水解时间一般为812min。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。Schiff试剂的作用Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素，就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注
8、明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。此外，Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。Giemsa染色法MGG由May-Grunwald染料和Giemsa染料组成。前者化学名为曙红亚甲基蓝，对胞质着色较好；后者对胞核着色较好。因此MGG染色，可兼两者的优点，常用于细胞涂片染色。2染液配制I液的配制：迈格染料 lg甲醇100ml在研钵内用少量纯甲醇将染料充分研磨成均匀一致的悬液，倒人烧瓶中，加入其余的甲醇后置入37温箱4-6小时，每隔半小时研磨半小时，然后放入深棕色瓶内，在室温下保存，2周后使用。临用前取上液40ml，加纯甲醇20ml混合用作工作液。液的配制：姬氏染粉 0.6g甘油 5
9、0ml甲醇100ml将姬氏染粉溶于甘油内，在研钵内研磨3-4小时，使之磨匀，加入纯甲醇后搅拌均匀,放入深棕色瓶内，室温下保存，2周后即可使用。磷酸缓冲液配制：1磷酸氢二钠20ml，l磷酸二氢钠30ml，加蒸馏水至1000ml，调整pH 6.4-6.8(用蒸馏水代替缓冲液，效果亦佳)。3染色步骤(1)自然干燥的细胞涂片(预先滴加甲醇固定更好)水平置于染色架上。(2)将I液(用缓冲液或蒸馏水5-10倍稀释)滴盖涂片上，lO-30分钟。(3)倒弃涂片上的I液，自来水漂洗干净。(4)立即滴盖液(用缓冲液或蒸馏水5-10倍稀释)在涂片上染色10-30分钟。(5)倒弃涂片上的液，自来水漂洗干净。(6)趁湿
10、加盖片或待干后镜检。4染色结果MGG染色将细胞核染成紫红色，细胞质和核仁染成蓝紫色。5MGG染色特点染色方法简单，且兼有瑞氏、姬氏两种染色的优点，并且涂片可保存十多年而不退色。MGG染色对胞质胞核染色效果均较好，结构清晰，所染细胞亦比HE染色的细胞大；同时对细菌、霉菌及胆固醇结晶的显示也很清楚。因此适用于淋巴造血系统的细胞标本、胸腹水、穿刺标本等。尤其对鉴别恶性淋巴瘤的类型，MGG染色更有帮助。苏木精-伊红（HE）染色HE染色是一种以形态为基础,结合应用化学技术对组织、各种细胞进行染色的实验技术,用于研究组织细胞的生理、病理和化学结构. 基本原理:去氧核糖核酸(DNA)两条链上的磷酸基向外,带
11、负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色.苏木精在碱性溶液中称蓝色,所以细胞核被染成蓝色.伊红Y是一种化学合成的酸性染料,在水中离解成带负电荷的阴离子,与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色,细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色,与蓝色的细胞核形成鲜明对比.伊红是细胞浆的良好染料. 一般染色组织切片厚度为3m左右,中枢神经系统68m,肾小球基底膜染色观察时要求1.52m标准厚度.染液制备：1.苏木精染液(1)称取0.5g苏木精、5.0g铵矾或钾矾和0.1g碘酸钠加温溶于70ml蒸馏水中；(2)加入30ml甘油和2ml冰乙酸充分
12、混匀后过滤即成母液；(3)母液可长期保存。用蒸馏水以1：20稀释母液即成工作液。工作液也较长时间储存，但每次染色前宜过滤，去除氧化膜；2.伊红染液伊红有醇溶性与水溶性之分。将0.5g伊红溶于100ml70%乙醇或蒸馏水即成工作液；染色步骤：1.用37的温BSS漂洗3次，每次20s-1min；2.用中性福尔马林固定30min；3.用蒸馏水漂洗1次，再用蒸馏水稀释的苏木精液(1/20)染10min；4.先用自来水冲洗几次，而后置入1%NaHCO3液中漂洗至蓝紫色；5.在放入伊红水溶液中染30s-1min；6.用蒸馏水冲洗，迅速通过丙酮2次，每次3-5min；7.通过2：1丙酮/二甲苯3次，每次1-2min；8.通过1：2丙酮/二甲苯3次，每次1-2min；9.放入纯二甲苯5-10min，用光学树脂封片后观察；10.把盖片置载物玻片上，令小盖片细胞面向上，用树胶封存，再覆以较大盖片；结果：原代细胞核染成红色，胞质染成蓝紫色。
