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1、 广州市锐博生物科技有限公司 GUANGZHOU RUIBO BIO CO., LTD www.siRNA.cn siRNA导入细胞的策略第一节 siRNA导入哺乳动物细胞的策略RNAi在哺乳动物细胞中通常用于阻断特定基因的表达从而研究基因的功能。成功的进行RNAi的问题在于使siRNA导入细胞，常见的做法是将靶向特定基因的大约21碱基长短的双链siRNAs(small interfering RNAs)，或者是4550-mer的发夹结构RNA（small hairpin RNA, shRNA）转染到细胞。此外，通过质粒表达siRNAs同样可以抑制特定基因的表达。1.1 siRNA的转染将一种
2、特殊构建的对称性 3突出2nt的约 21nt (nucleotide)siRNAs双链复合物通过阳离子脂质体可以转入哺乳动物细胞中。1.2 shRNA转染引入细胞4550-mer的发夹结构RNA（small hairpin RNA, shRNA）转染到细胞。shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA，从而引发基因沉默或者表达抑制。1.3 胞内表达siRNA 体内载体合成siRNA,是最近迅速发展起来的新技术。它是 2 0 0 2年 2月 ,由Patrick等首先报道的利用载体在细胞体内稳定地表达siRNA ,从而抑制哺乳动物细胞靶基因表达的方法1,2。其基本思路如下 :细胞内存在RNA po
3、lymerase III,它可以识别6启动子 ,从而使启动子后的基因转录成。当模板连续出现 3 5个“”碱基时 ,转录就会终止。根据这一机制 ,可以设计一种能表达的质粒 ,其组成包括四部分 :常用质粒的基本序列 ;6启动子 ,位于克隆位点的上游 ;克隆位点 ;模板序列 ()。这部分序列具有如下特点: 含RNAi序列 ,对哺乳动物而言 ,通常为21-23个核苷酸；发卡结构环状部分 ,通常有 4 7个核苷酸 ;靶序列的反向互补序列; 35个核苷酸“T”。将具有如上结构的质粒导入细胞内, 体内的RNA polymerase III就可以合成一条链 ,这条链可以通过两端的 2 1个左右的核苷酸反向互补
4、特性而形成发卡样双链结构 ,从而起到基因抑制作用。这种技术的使用 ,操作简便 ,成本低 ,与直接导入SiRNA相比 ,DNA质粒更易导入细胞内 ,而且质粒导入细胞后存在时间长且稳定 ,对靶基因的表达抑制效率高 ,便于进行较长时间的基因功能研究 ,因而近日来成为一种热门技术 ,Cythla等2002-05对载体进行了改进 ,使RNAi效率提高到 99%以上3。他们的作法是 ,在上述载体的克降位点上游加入了人6的前 2 7个核苷酸 ,在克隆位点下游又加上一段能形成发卡样结构的核苷酸序列及转录终止信号poly(u)。据报道 ,这种改进的质粒大大增加了siRNA的转录效率及稳定性 ,同时对靶基因的抑制
5、作用也大大增加 ,因而被认为是迄今报道的最完善的质粒载体。胞内表达siRNA，尽管细节各有不同，但载体大都是用RNA聚合酶III（Pol III）启动子启动编码shRNA(small hairpin RNA) 的序列。选用Pol III启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到45个连续的U即终止，非常精确。当这种带有Pol III 启动子和shRNA编码序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，抑制范围包括外源基因和内源基因。采用这种方法的优点在于，通过siRNA表达质粒的选择标记，siRNA载体能够更长时间地
6、抑制目的基因表达。当然还有一点，那就是由于质粒可以复制扩增，相比起化学合成来说，这就能够显著降低制备siRNA的成本。 pSilencer siRNA 表达载体系列是用于在培养的哺乳动物细胞中表达siRNA的一系列载体。在载体上包含有RNA Pol III启动子，氨苄抗性基因和大肠杆菌复制子，只要将编码一小段对应目的基因特异序列的、其RNA能形成发夹结构的DNA序列插入载体中Pol III 启动子的下游，转入哺乳动物细胞，载体就能表达出发夹结构的RNA，这种RNA很快在细胞中加工成为siRNA。 这些表达载体已经成功地在Hela细胞中抑制了包括Cyclophilin、GAPDH、p53、c-m
7、yc在内的多个基因的表达。实验表明：能够被化学合成或者体外合成的siRNAs抑制的基因同样可以被表达相同序列的载体生成的siRNAs抑制。 载体pSilence 1.0-U6是采用小鼠U6 Pol III启动子。是由哈佛大学开发的载体，已经成功地在Hela、H1299, U-2 OS和C-33A细胞中敲除了cdk-2和laminA/C的表达。这个载体经过Apa I和EcoR I酶切线性化和纯化，先合成一对55-mer的寡核苷酸，带有4个碱基的突出，一起退火、快速连接就可以转化。pSilencer 2.0-U6 and pSilencer 3.0-H1，这两个载体带有不同的RNA Pol III
8、 启动子，pSilencer 2.0-U6带的是人的U6启动子，pSilencer 3.0-H1则是用H1 RNA启动子（RNase P的一个组成部分）。这两个载体都是用BamH I和Hind III线性化并且经过纯化的，方便定向克隆。在2003年6月1日的 基因与发育杂志上，Shunsuke Ishii和他的同事报道，他们构建了一个新RNAi载体，这种方法既避免了引起干扰素应答，又允许组织特异性抑制基因表达。这个载体被命名为pDECAP，标志着RNAi转基因技术取得重大突破。在迄今开发的RNAi转基因系统中，发卡状小RNA由RNA聚合酶III启动子或病毒启动子表达。然而这些系统无法用于组织特
9、异性敲除基因功能，因为这些启动子在所有细胞类型中都有活性。而这种系统是利用RNA聚合酶II启动子来表达发卡状dsRNA, 因此应用这种系统可以创造出组织特异性基因敲除动物。PDECAP载体系统是由RNA聚合酶II启动子来表达dsRNA，该启动子只在特定细胞类型中激活。Ishii博士和他的同事可以选择敲除哪些组织中的基因功能。为避免干扰素应答，Ishii博士和它的同事对载体系统进行了改造，使其可以转录缺少将RNA从细胞核转移到细胞质的序列的dsRNA。相反,pDECAP表达的dsRNA被扣留在细胞核中，在这里被加工成siRNA。这些siRNA然后被释放到细胞质中，直接降解靶mRNA而不会激起干扰
10、素应答。1.4 微注射和注射在小鼠卵母细胞和植入性胚胎中微注射RNA技术 ,如它能干涉合子中E-cadherin的表达 ,破坏胚层的生长发育 ,表型类似于E-cadherin基因敲除小鼠基因。美国哈佛医学院的科学家在最新一期英国自然医学杂志上报道，他们首次使活体动物的基因沉默，治愈了实验鼠的肝炎。这次试验的做法是：在实验鼠尾部的血管注入靶定Fas基因的siRNA，发现有90%的肝细胞接受到了这种RNA分子。Fas蛋白质的产量变为原来的十分之一。（Nature Medicine 2003;10.1038/nm828）对于人来说，身体比老鼠大的多，血液循环系统也庞大。科学家正在寻找把siRNA送到
11、人体特定部位的方法，以便验证RNAi在人体中的效果。第二节 siRNA导入低等动物个体的策略dsRNA首先应用于非脊椎动物中的线虫,dsRNS导入线虫有两种途径 :微注射dsRNS ;线虫进食含的 .也可产生弱效应 ,且效应是可逆的。2.1 微量注射在研究线虫、果蝇、涡虫的时 ,普遍采用了双链微量注射方法。的注射方式有三种 :直接注射(注射前退火形成稳定的双链 );在低盐浓度下把有义及反义混合后注射 ;把有义及反义分开注射 ,但间隔必须尽量短 ;如果两者注射间隔时间超过 1小时 ,则基因干涉能力将迅速下降。2.2 低等动物的喂食Fraser等与Gnczy等人在研究RNAi上取得了可喜的成绩 ,
12、他们利用RNAi特异性这一优点 ,合成了上千个与开放读框相对应的双链和表达这些双链的细菌克隆 ,分别用微量注射和喂食的方法导入线虫体内 ,干扰同源基因的表达 ,再运用子代分析和定时差异干扰比较 (differential interference contrast, DIC)显微分析法 ,成功地在基因组水平上大规模地筛选了功能基因 (称为筛选 ) ,证实了线虫染色体和染色体中早期胚胎细胞分裂及细胞代谢等有关的所有基因功能 ( ,2 0 0 0 ;,2 0 0 0 )。其中,等在研究中设计了可表达的细菌文库,由于文库中的细菌克隆可以复制,因此,用喂食进行的筛选具有低成本、高效、高重复使用性的优点
13、2.3 电穿孔转染恶性疟原虫 dhodh和 aro C基因用常规PCR从恶性疟原虫基因组 DNA中扩增而来。将 ds RNA加入到同期疟原虫中 ,对环状滋养体用 5%山梨糖醇培养 42 - 44h,对晚期滋养体需再培养 2 4h,然后用 2 0 0 ,2 5F和 6. 2 5Kv Cm-1 的电流进行电穿孔。用RPMI- aro培养基稀释并分装至 96格的培养皿中 ,每个样本一式三份 ,每 2 4h更换一次培养基。疟原虫的生长可通过测量放射性示踪物质次黄嘌呤的结合进行监测2.4 体内表达siRNA 利用热诱导控制表达形成干扰基因表达 ,可以控制在特定时期表达 ,拓展了干扰的应用空间 .利用热诱
14、导可以使整个生物体产生全局性的干扰 ,而不至于产生传统微注射干扰带来的镶嵌现象5 目前采用的解决方法主要是利用因子载体 ,以更准确地了解这类基因功能 ,在其上游构建热启动子和构建内源的可稳定遗传的基因( ),将该载体转入果蝇的品系中 ,在需要时热诱导基因表达 ,形成发夹结构 (hairpin loop RNA),以此类的结构实现对基因表达的干扰 ,且效果与注射相似 . 将目的基因的靶序列以反向重复的方式 ,由热激启动子控制在转基因生物中表达。热激处理后 ,反向重复序列在细胞内开始转录 ,其产物会形成具发夹环结构的 ,从而产生,使目的基因沉默1 2 。这种改进的技术与传统的技术相比 ,具有明显的
15、优点 :首先转基因可以遗传给后代 ,有利于突变的分析 ;其次可以被诱导产生 ,能够在发育特定阶段出现 ,从而使研究发育早期必需基因在发育晚期的功能成为可能 ;另外 ,当用细胞特异性启动子控制的表达时 ,可以研究特定基因在不同器官中的功能利用热诱导控制表达形成干扰基因表达 ,可以控制在特定时期表达 ,拓展了干扰的应用空间 .利用热诱导可以使整个生物体产生全局性的干扰 ,而不至于产生传统微注射干扰带来的镶嵌现象;利用序列可以构建大量稳定的果蝇品系 ,比如一些温度敏感型 ,而在过去 ,这些突变型只能通过对开放末端( )进行反复筛选得到.如果结合4 系统或组织特异性的启动子 ,可以进行一定时期一定组织特异的表达以干扰相应的基因表达 ,从而精确知道产生的时间和
