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1、人造海水的配方*（引自Chemical Oceanography ,Second Edition , Millero F J,1996）名称质量（10-3kg）氯化钠氯化镁硫酸钠氯化钙氯化钾重碳酸钠溴化钾硼酸氯化锶氟化钠23.985.0294.011.140.6990.1720.1000.02540.01430.0029*：水化合物的总重量为1kg.海洋微生物及其代谢产物-林永成主编2003细菌的分离：牛肉膏蛋白胨琼脂、营养琼脂等是分离细菌的常用培养基，前苏联细菌学家设计的ZOBELL 2216E培养基是培养好气性异养细菌较好的培养基，可培养多种细菌，SIMIDU培养基也常用于海洋好气性异养细
2、菌的分离，PFENNIGS培养基适用于海洋光合细菌的分离，分离海洋弧菌可采用TCBS培养基，培养基PH一般为7.2-7.6,盐度为28到30,培养温度28到37， 培养时间1到7天，注意观察平板菌落变化，1到2天先挑取大菌落，5到7天后再挑取小菌落，为防止真菌的污染，常在培养基中添加一定的抗真菌抗生素，如制霉菌素、两性霉素、放线菌酮等。放线菌因生长缓慢且菌落不大，一般不会对细菌的分离产生影响。放线菌的分离：1 放线菌是数量最多、最常分离到的G+，JENSEN的研究表明，离海岸越近，在0到1米水深的底泥样本中，链霉菌占分离的放线菌总数的86%，小单孢菌占12%，其他占2%。2 分离培养基多采用合
3、成培养基（高氏合成一号、精氨酸、天门冬素培养基）和有机培养基（HV、YE、WAKSMAN、bennett）,高氏合成一号是分离的常用培养基，适合尤其是链霉菌的生长，但细菌和真菌也大量生长。HV是以腐植酸为唯一碳、氮源的培养基，对小单孢菌、小双孢菌、指孢囊菌、链孢囊菌的选择性高，但是生长的放线菌形态不完整，难以观察，给挑菌工作带来困难。3 抑制剂放线菌酮、制霉菌素可抑制真菌，青霉素、链霉素可抑制细菌，重铬酸钾对真菌和细菌均可抑制，0005%-001%是较理想的分离抑制剂，有三个特点：抑制细菌和真菌的生长，不影响放线菌的正常生长，还可促进一些放线菌孢子的萌发，价格低廉。4 样品预处理120干热处理
4、样品1小时能大大减少细菌和链霉菌的数量，而对稀有放线菌影响较少，甚至能利于孢子萌发，由于海洋样品多潮湿，同时孢子对湿热敏感，故采用50到55度的热处理会促使大部分孢子萌发。化学杀菌剂法杀菌剂 苯酚 SDS 葡萄糖酸洗必泰CG 苄索氯氨BC 碳酸钙 氯化钙富集的放线菌 非链霉菌属 小单孢菌 智囊孢菌 小双孢菌 非链霉菌属 小四孢菌 所有放线菌 放线双孢菌 小四孢菌 链孢囊菌差速离心 浓缩真菌的分离：到2000年止已认知的海洋真菌仅仅444种，包括177属360种的子囊菌（占811%），51属74种半知菌（占167%）和7属10种的担子菌（占22%）选择性富集海水样品可通过浓缩或过滤，用无菌的04
5、5m孔径的硝酸纤维素滤膜过滤海水，然后直接把滤膜放在培养基上培养。分离酵母菌时，可将含50-200氯霉素的分离培养基用浓盐酸调PH值至34酸性条件下可抑制很多细菌生长。植物内生真菌分离方法：进行分离前，对植物材料表面进行彻底消毒非常必要，典型的消毒剂有70%-90%的乙醇、漂白剂、1%的过氧乙酸和3%-30%的过氧化氢，多采用PDA培养基，并加入庆大霉素、氯霉素、链霉素等抗生素，抑制细菌和放线菌的生长。鉴定：16S rRNA相对分子量适中，易于进行序列测定和分析比较，可以为细菌鉴定提供相对稳定可靠的信息，广泛用于评价生物遗传多态性和系统发生关系。18S rRNA成为目前研究真菌属物种多样性的分
6、析比较。原核微生物rRNA包含23S、16S、5S，真核微生物转录区包含5S、18S、58S、28S。（C+G）mol在种内不超过4%,属内不超过10%。低于2%没有分内学意义。只具有否定价值，需与表型特征相结合。16S rDNA成为细菌种属鉴定和分类的标准方法，适用种及种以上的分类单位。同源性95%的菌可归为同一属，97%可视为同一种，大于97%时必须测定DNA-DNA杂交率是否大于70%才能确定是否为新种。由于对同种内的不同菌株分辨力较差，更适合研究属及属以上的菌株。18S rDNA普遍用于真菌物种的鉴定分析。植物内生真菌的分离 叶、叶脉、茎、树皮(韧皮部)等样品用自来水冲洗掉泥土，然后进
7、行严格的表面消毒程序：依次浸泡在75酒精lmin，3一5有效氯的次氯酸钠溶液3 min。75的酒精O5 min，然后再用无菌水冲洗3遍。晾干后，在超静台将其剪成约O5 cm05 cm左右小片。将处理好后剪成的小片铺于PDA平板上，加入氯霉素与链霉素各50斗gmL抑制细菌的生长，在26培养培养23周分离内生真菌。这些平板在第1周要每天检查1次，然后可以3、4 d检查1次。一旦发现有菌丝从组织小块长出，应马上将其转接到另一新的平板上，经几次纯化保存于PDA斜面。植物组织样品处理: 将采集的红树林植物样品先用流动的清水冲洗干净,再超声清洗彻底去除植物组织表面的杂质, 把植物样品剪切成15 cm 左右长度的节段进行表面消毒。样品依次用次氯酸钠(含5%有效氯量)浸泡5 min,无菌水清洗3 次, 75%酒精浸泡3 min, 无菌水清洗3次, 晾干, 用粉碎机把植物组织粉碎备
