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1、分析化学在生物检测中的应用 分析化学相关技术在盘锦检验检测中心生物检验部的许多检测项目中得到了广泛的应用。其中包括：血常规、尿常规、血液生化分析、荧光定量PCR技术、ELISA技术、流式细胞术以及病原体的生化鉴别等。为疾病的预防控制提供的巨大的技术支持。 1 血液分析仪及其临床应用电子血细胞计数仪现已广泛应用于临床医学检验工作当中，随着电子技术、流式细胞术、激光技术、单克隆抗体、计算机等高科技在血细胞分析仪上的应用，血液分析仪的研制水平不断提高，检测原理不断完善，测量参数不断增多。现代血液分析仪（HA）具有下列特点：1、 自动化程度越来越高2、 提供参数越来越多（能提供18-40多个参数，如：
2、核红细胞数、淋巴细胞亚群数等）3、 精密度越来越高4、 速度越来越快（50-150样品/小时）5、 强大的指控功能6、 智能化程度越来越高（提供强大的散点图或直方图、提示异常结果报警信号、备有专家诊断系统和远程会诊功能等）1.1 检测项目 白细胞计数（WBC）、红细胞技术（RBC）、血红蛋白测定（Hb）、红细胞压积（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白（MCHC）、红细胞体积分布宽度（RDW）、血小板计数（PLT）、白细胞五项分类（WBC differential count）等。1.2 检测原理1.2.1电阻抗法血液分析仪检测原理（1） 电阻抗法血细胞技术原理（库尔特原理）
3、：容器感应区内电阻增高，引起瞬间电压变化形成脉冲信号，脉冲振幅越高，细胞体积越大；脉冲数量越多，细胞数量越多，由此得出血液中血细胞的数量和体积值。（2） 白细胞分类计数原理：经溶血剂处理的、脱水的、不同体积的白细胞通过小孔时，脉冲大小不同，将体积为35-450fl白细胞，分为256个通道，淋巴细胞位于35-90fl的小细胞区；粒细胞（中性粒细胞）位于160fl以上的大细胞区；单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、原始细胞、幼稚细胞等，位于90-160fl的单个核细胞区，又称为中间细胞区，又称为中间型细胞。仪器根据各种细胞亚群占总体的比例，计算出各亚群细胞的百分率，并同时计算各亚群细胞的绝对值，
4、显示白细胞体积分布直方图。（3） 血红蛋白测定原理：血红蛋白与溶血剂中的某些成分结合形成一种血红蛋白衍生物，在特定波长（530-550nm）下比色，吸光度与稀释液中的Hb含量成正比，最终显示Hb浓度。氰化钾的溶血剂与血红蛋白作用后形成氰化血红蛋白，其最大吸收峰接近540nm。1.2.2光散射法血液分析仪检测原理（1） 光散射法白细胞计数和分类计数：激光与细胞化学法；容量、电导、光散射（VCS）法；电阻抗与射频法；多角度偏振光散射（MAPSS）法。（2） 光散射法红细胞检测原理：低角度（2-3）光散射能测量单个红细胞体积，高角度（5-15）光散射能测量单个红细胞血红蛋白浓度，得出MCV、MCH、
5、MCHC值，并显示红细胞散射图、单个红细胞体积和血红蛋白含量直方图。（3） 光散射法血小板测定原理：高角度（5-15）光散射能测量细胞折射指数（RI），低角度（2-3）光散射能测量细胞大小。在二维散射图上得出血小板数量和相关参数。（4） 网织红细胞计数原理：利用新亚甲蓝使网织红细胞RNA着色，加入使红细胞内Hb溢出的试剂，使其成为“影细胞”，然后采用VCS原理，得出网织红细胞数和相关参数；利用碱性槐黄O等荧光染料与织网红细胞内的RNA结合，以波长488nm氩氖激光束为激光源照射网织红细胞，得到前向散射光（细胞体积大小）和荧光强度（胞质内RNA多少），形成二维显示散点图，得出网织红细胞数和相关参
6、数。（5）2 尿液常规分析及其临床应用2.1 尿干分析仪组成 尿干化学分析仪由机械系统、光学系统、电路系统三部分组成。2.2试剂带 以滤纸为载体，将各种试剂成分浸渍后干燥后作为试剂层。多联试剂带一次尿液可同时测定多个项目，是目前国内较常用的。多联试剂带采用多层膜结构：第一层为尼龙膜，起保护作用，防止大分子物质对反应的污染；第二层为试剂层和碘酸盐层，试剂层与尿液所测定的成分发生化学反应，碘酸盐层可破坏维生素C等干扰物质，有些无碘酸盐层，但相应增加了一块检测维生素C的试剂块已进行某些项目的校正；第三层为吸水层，可使尿液均匀、快速的浸入，并能抑制尿液流到相邻反应区；最后一层选取尿液不浸润的塑料片作为
7、支持体。2.3 检测原理 尿液中相应的化学成分使尿多联试带上各种含特殊试剂的模块发生颜色变化，颜色深浅与尿液中相应的物质浓度成正比；将多联试带置于尿液分析仪比色进样槽，各膜块依次受到仪器光源照射并产生不同的反射光，仪器接受不同强度的光信号后将其转换为相应的电讯号，再经微处理器由下列公式计算出个测试项目的反射率，然后与标准曲线比较后校正为测定值，最后以定性或半定量方式自动打印出结果。 式中：R为反射率；Tm为试剂膜块对测定波长的反射强度；Ts为试剂膜块对参考波长的反射强度；Cm为标准膜块对测定波长的反射强度；Cs为标准膜块对参考波长的反射强度。尿液分析仪测试原理的本质是光的吸收和反射。试剂块颜色
8、的深浅对光的吸收、反射是不一样的。颜色越深，吸收光量值越大，反射光量值越小，反射率越小；反之，颜色越浅，吸收光量值越小，反射光量值越大，反射率也越大。换言之，特定试剂块颜色的深浅与尿样中特定化学成分浓度成正比。2.4 尿干化学分析仪的检测参数2.4.1检测项目 用于初诊患者及健康体检时用的8-11项筛检组合试带。8项检测项目包括：酸碱度（pH）、蛋白（PRO）、葡萄糖（GLU）、酮体（KET）、胆红素（BIL）、尿胆原（URO）、红细胞或血红蛋白或隐血（ERY或HB）和亚硝酸盐（NIT）；9项检测项目在8项基础上增加了尿白细胞（UEL，WBC）；10项检测项目又在9项的基础上增加了尿比密（SG
9、）；11项则又增加了维生素C。用于以确诊疾病的疗效观察，如尿糖、尿蛋白等单项试带和各种组合型试带。2.4.2检测参数 酸碱度：采用酸碱指示剂法。比密：采用多聚电解质离子解离法。尿比密偏高时，尿液中所含盐类成分较多，试剂带中电解质多聚体释放出的H+，溴麝香草酚蓝为分子型，呈现黄色；反之，溴麝香草酚蓝为电离型，呈现蓝色。尿糖：采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法，常见的色素源（底物）为邻联甲苯胺、碘化钾等。蛋白质：采用pH指示剂蛋白质误差发，即在pH3.2的条件下，溴酚蓝产生的阴离子与带阳离子的蛋白质结合发生颜色变化。当尿液蛋白浓度有低至高时，其颜色由黄绿色经绿色至蓝色，当尿蛋白阴性时，试剂膜块呈原有的
10、黄色。酮体：采用硝普钠法（亚硝基铁氰化钠法），碱性条件下尿液中的乙酰乙酸、丙酮可与硝普钠起紫色反应，颜色的深浅与酮体含量成正比。胆红素：采用偶氮反应法。尿胆原：采用醛反应法或重氮反应法。尿红细胞或血红蛋白：采用红细胞类过氧化物酶法。血红蛋白类过氧化物酶催化试剂膜块中的过氧化氢烯钴和色素源四甲替联苯胺。亚硝酸盐：采用硝酸盐还原法。白细胞：白细胞酶酯法。3 酶联免疫吸附实验（ELISA） 3.1 ELISA基本原理 将抗原（或抗体）吸附在聚苯乙烯的反应板上后，加入酶标抗体（或酶标抗原）与抗原（或抗体）特异结合，使酶也结合到载体上，洗去游离的酶标抗体（或酶标抗原），加入底物显色，根据颜色有无和深浅通
11、过酶标仪在特定波长下进行吸光度测定，对而对测定样品进行定性或定量分析。在分析化学领域属于光谱分析。在ELISA中一般采用辣根过氧化物酶（HRP），其次是碱性磷酸酶（AP）对抗原（或抗体）进行标记。其中常用的底物包括四甲基联苯胺（TMB）（492nm）和邻苯二胺（OPD）（450nm）。在ELISA测定方法中三种必要的参与物是固相抗原（或抗体）、酶标记抗原（或抗体）和底物。3.2常见的ELISA检测方法包括 双抗原夹心法、双抗体夹心法、间接测抗体法、竞争法、捕获法测IgM抗体、亲和素和生物素的ELISA。3.3 ELISA检测方法在疾病预防控制中的应用 病原体入侵人体或健康人接种疫苗后，病原体或
12、疫苗作为抗原物质能够刺激机体产生抗体。应用ELISA测定血清中的抗体含量能够从侧面反映机体是否感染某种病原体以及疫苗免疫效果评价，进而为疾病预防检测的目的有效快捷的检测手段。盘锦检验检测中心生物检测部的诸多检测项目均利用ELISA检测技术完成，其中包括：艾滋病、梅毒、甲型肝炎、戊型肝炎、风疹、麻疹、流行性出血热、口蹄疫、猪瘟、小反刍兽疫等疾病的抗体进行检测。 在各种分析仪器的发明和研制过程中,有着许许多多的发人深省、鼓舞人心的历史事例,在这其中无数化学家做了大量艰苦卓绝的探索工作,取得了令人瞩目的成就,这些伟大的化学家们都具有令人敬仰的个人品质及孜孜不倦投身科学的奉献精神。在仪器分析发展史中有
13、许多位科学家获得了诺贝尔奖,回顾这些对近代科学发展的重大贡献, 追踪科学家走过的足迹, 激发了我参与科研和追求创新的热情。核磁共振从其一开始就与诺贝尔奖联系在一起:1945 年以Bloch 和Purcell 为首的两个课题组同时发现了核磁共振现象,为此他们获得了1952 年诺贝尔物理学奖; Richard Ernst 教授因为他在高分辨率核磁共振二维波谱新技术方面的贡献而获得1991 年诺贝尔化学奖; Kurt Wuthrich 教授又因其在应用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构的新方法而获得了2002 年诺贝尔化学奖。由于核磁共振提供分子空间立体结构的信息,目前已经发展成为分析分子结构
14、和研究化学动力学的重要手段,在有机化学、生物化学、药物化学等领域里得到了广泛的应用,这反映出了核磁共振技术的迅猛发展及其对世界前沿研究工作的巨大贡献。在质谱分析发展史中,先后有3 位科学家获得了诺贝尔化学奖。他们是:英国科学家Aston 设计了世界上第一台质谱仪,并使用该仪器发现了212 种同位素,将人类研究微观粒子的手段大大向前推进了一步,因而获得了1922 年诺贝尔化学奖;日本科学家田中耕一和瑞士科学家Kurt Wuthrich 共同开发出生物大分子的质谱分析技术和发展了基质辅助激光解析电离法,为发展生物大分子的鉴定与结构分析方法所做出了重大贡献,因而获得了2002 年诺贝尔化学奖瑞典皇家
15、科学院称赞他们的研究工作“提升了人类对生命进程的认识”。随着科学技术的进步,仪器分析方法的发展日新月异,从航天工程使用的特种材料到生命科学的过程研究,先进的分析仪器和有效的分析方法都成为了不可或缺的手段。对于当今的大学生来说,由于计算机和互联网的迅速发展,使得他们获得最新科技信息的途径被大大地拓宽。因此,将最新的分析仪器和分析方法介绍给学生,对于他们理解最前沿的科技动向具有很有利的帮助作用,从而激发了他们对所学专业的热爱以及为科学献身的崇高理想。比如,傅立叶变换红外光谱(FTIR) 可提供有关分子结构的多种信息,辅以二阶导数、去卷积、曲线拟合等解析方法可以研究蛋白质二级结构的变化规律。近几年,
16、应用FTIR从分子水平的角度研究癌症正是生物医学领域的热门课题4 。癌组织和正常组织的谱图表明癌组织样品与正常样品的红外光谱存在明显差异,通过谱图解析可直接或间接地阐明引起谱图变化的主要原因,以及细胞癌变的可能机理及病程进展各期。通过在教学过程中穿插相关的图片、实验数据等,生动地将正常组织与肿瘤组织的红外谱图在谱型、强度、频率等谱学参数上存在明显的差异展示给学生,从而使学生了解红外分析方法的重要意义。在对生物大分子的分析中,生物质谱与其他分析方法相比具有准确性和灵敏度高、快速、易于大规模和高通量操作等优点,因此在基因组学和蛋白质组学研究中扮演着越来越重要的角色5 。例如,在蛋白分析技术中生物质谱
