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1、基因工程综合实验 武汉科技大学医学院生化教研室目 录分子生物学实验综合规程3参考书目 3实验内容4实验一 实验基础知识和基本技能培训5实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备7实验三 质粒DNA的转化8实验四 碱裂解法提取质粒DNA9实验五PCR基因扩增11实验六DNA的限制性核酸内切酶消化13实验七琼脂糖凝胶电泳检测DNA15分子生物学实验综合规程p 上课时间提前5分钟进入实验室；不迟到、不早退，无故旷课累计3次没成绩；p 请假须医院病假条或班主任签字的假条；p 上课时需穿实验服，不许在实验室内吃东西，不背着书包做实验，不穿拖鞋进实验室；p 实验课期间不许打闹、闲聊等，不大声喧哗，保持课堂纪律，实验
2、过程中，至始至终需全组同学一起完成，任何人中途不得缺席。p 必须做到课前认真预习，课间做好实验记录、课后详细总结实验结果并按时提交实验报告；p 公用试剂不得污染！每次都必须用新枪头。公用台上公用试剂不得私自拿到自己实验台上；p 不得私自拿走或乱放别人的实验物品、实验产品；p 不得擅自使用实验室中非本实验仪器、试剂。p 实验废液不随便倾倒，随时保持实验台的整洁；p 爱护实验器材，实验器材损坏必须按规定赔偿；p 实验前按仪器性能与要求，进行仪器预热；p 实验完成后检查电源插座，用完仪器后必须复位，仪器清洁干净 、摆放整齐；每组实验物品齐全，需教师验收，枪量程要归位，发现问题及时报修；p 每位同学负
3、责自己实验台面和柜体的卫生，值日生负责公用实验台、地面等处卫生；p 每次轮到打扫卫生的小组，要认真做好值日工作，离开实验室须向教师声明；p 同学与老师之间、同学与同学之间、实验班与实验班之间一定要互相协作配合保持公用房间卫生，注意门窗水电的安全。p 遵守通用的实验室规则。违反上述任何一条规则责任自负，并要扣分，造成损失要照价赔偿。参考书目：分子生物学实验指导，魏群 主编，高教出版社分子生物学实验指导，刘进元 主编，清华大学出版社实 验 内 容实验一 分子生物学实验的基本知识和基本技能培训实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备实验三 质粒DNA的转化实验四 碱裂解法提取质粒DNA实验五PCR基因扩增实
4、验六DNA的限制性核酸内切酶消化实验七 琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验一 实验基础知识和基本技能培训实验目的 学习和掌握分子生物学实验的基本技术和技能，了解分子生物学实验中常用的仪器设备，熟悉常用玻璃器皿、耗材。实验原理 通过多媒体、胶片、板书、实物演示等各种教学方式，让学生初步学习和掌握分子生物学实验的基本知识和基本技能，了解分子生物学实验常用仪器设备，熟悉常用玻璃器皿、耗材。1. 分子生物学实验综合规程（见前页）2. 分子生物学实验设备1) 温度控制系统：冰箱：4 、-20、-70 -样品、试剂和材料等的保存2) 恒温培养箱：细菌平板的培养3) 恒温空气摇床；菌体的培养4) 灭菌器: 培养基
5、、试剂、耗材等的灭菌5) PCR仪：PCR 扩增、保温实验等6) 恒温水浴及微量加热器：保证实验温度的恒定7) 电泳仪：电泳时提供电压和电流8) 电泳槽：核酸或蛋白质的电泳定性分析时的凝胶支架9) 凝胶成像系统：电泳结果的定性和定量分析10) 紫外分析仪：电泳结果的定性分析11) 台式高速冷冻离心机：样品的分离12) 分光光度计：样品的定量测定13) 超净工作台：提供洁净工作环境14) 电子天平：样品、试剂等的称量15) pH 计：精确的pH值测定16) 移液器；液体试剂的精确取量17) 制冰机：保证操作过程中温度的恒定3. 分子生物学基本技术3.1实验规范训练仪器的操作要求：a) 仪器在未经
6、培训前，不得擅自使用b) 严格按操作规程使用仪器，c) 有些仪器必须有教师在场时才能使用，并由教师操作d) 违反规定的使用者，造成的后果由使用者承担3.2实验规范训练量程的选择1) 天平2) 烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶不同规格3) 量程的选择移液器3.3实验规范训练标签1) 所用的器皿上一定要做标记2) 标签一定要贴到固定的位置3) 标签上应包括具体的名称、组别、实验班、日期3.4实验规范实验操作1) 详细记录和分析实验结果并按时提交实验报告2) 实验中一定要处处用心、勤动手，多问为什么3) 仔细操作和观察4) 保留好每一步的实验样品，在确准的情况下才能当废液扔掉4 实验准备4.1 清点和熟悉
7、常用玻璃器皿、耗材等4.2 洗涤本学期实验用玻璃器皿4.3 配制试剂1) 0.1 mol/L CaCl2 100 mL2) 5 mol/L NaOH 100 mL 胶塞3) LB液体培养基 100 mL 胰蛋白胨（typtone) 1g 酵母提取物（yeast extract) 0.5g NaCl 1g 加部分水溶解后加20L 5 mol/L NaOH，定容到100 mL（40 mL到两个250mL锥形瓶，3 mL分别到大试管中，用于预培养及复苏）4) 10%(w/v)SDS储液 50 mL，室温保存5) 1 mol/L Tris 200 mL6) 2 mol/L HCL 100 mL7) 0
8、.5 mol/L EDTA 100 mL 80 mL水中加18.61g EDTA-Na2H2O，用NaOH调 pH 8（约需2g NaOH），后定容至100 mL8) 5xTAE 1000 mL9) 70%乙醇 500 mL10) Amp ：100 mg/ mL 20ml，分装每管 1 mL，20保存注意：先将所需烧杯、量筒、玻棒、双蒸水、微量离心管灭菌待温度降到室温后，在超净台中配制，再用一次性滤器过滤分装于1.5 mL无菌微量离心管中，20保存4.4 高温灭菌1) LB液体培养基 2) 1.5mL离心管 2瓶/组3) 枪头/1组 ： 1mL 1盒，200uL 1盒4) 培养皿 12套/组
9、5) 无菌水 100 mL /班 6) 0.1 mol/L CaCl2实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备实验目的 制备出感受态细胞。实验原理 感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15的无菌甘油于-70保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。一、材料 大肠杆
10、菌 E.coli DH5，100ml三角瓶，1.5ml 离心管(又称eppendorf管), 离心管架，1000 ul 、200ul枪头，大量冰块，二、设备 微量移液器(200l,1000l)，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，恒温摇床、冷冻离心机, 超净工作台, 紫外光度计，双蒸水器，冰箱等。三、试剂准备1、LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10 g，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调pH至7.5, 加水至总体积1升，高压下蒸气灭菌15分钟。2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。 3、高压灭菌的
11、0.1mo1L CaCl2：母液1M CaCl2 147 g CaCl2 2H2O，加水到1L4、高压灭菌过的30甘油四 操作步骤 大肠杆菌感受态细胞的制备（1） （已预先准备好）从新活化的E.coli DH5菌平板上挑取一单菌落（超净工作台操作），接种于35ml LB液体培养中，37振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1：1001：50转接于20ml LB液体培养基中，37振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔2030min测一次OD600nm，至OD600nm0.5时停止培养；（2） 取培养液1.5ml转入微量离心管中，在冰上冷却10min，于4，5000rmin离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）。（3） 倒净上清培养液，用1ml冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴，04，5000rmin离心10min；（4） 弃去上清液，加入500l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。04，5000rmin离心10min；（5） 弃去上清液，加入100l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；（6） 制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积
