《蛋白质组分析.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质组分析.doc（14页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、蛋白质组分析蛋白质组（proteome）源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，其定义为proteins expressed by a genome，即一个基因组表达的全部蛋白质。目前认为蛋白质组的内涵是一个细胞、一类组织或一种生物的基因组所表达的全部蛋白质。蛋白质组学（proteomics）是研究蛋白质组的一门新兴学科，旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式。蛋白质化学着重于单一蛋白质结构、功能的研究，例如某一种蛋白质或蛋白质亚基的全序列分析，三维立体结构的确定，这样的结构如何执行功能、在生理上所扮演的角色，以及代谢的生化机制等。蛋白质组学则是研究多种蛋白质组
2、成的复杂系統。Proteomics的字尾“-omics”的意思是“组学”，代表对生物、生命体系研究工作方式的重新定义，也就是说，蛋白质组学是对基因组所表达的整套蛋白质的分析，其研究对象是多蛋白质混合物的“系统”行为，而不是“单一组成”的行为。它通过对一个大系统中包含的所有蛋白质进行分离、鉴定、表征和定量，提供关于该系统准确和全面的数据和信息。蛋白质组与基因组通常，一个细胞中表达两类基因：必须功能蛋白质的基因；行使细胞专一性功能蛋白质的基因。因此，一种生物有一个基因组，但有许多蛋白质组。因此，蛋白质组与基因组在内涵上有很大的不同，主要表现在以下四个方面：（1）蛋白质组具有多样性图11.1 基因以
3、多种mRNA形式剪接的示意图EXON：外显子，真核细胞基因DNA中的编码序列。这样的序列可转录为RNA并进而翻译为蛋白质。P代表磷酸化，sugar代表糖基化，lipid代表脂肪酰化，Ub代表泛素化3。（2）在蛋白质组的研究中，时间和空间的影响都不可忽视（3）蛋白质间主要以相互作用的形式参与生命活动（4）蛋白质组研究对技术的依赖性和要求远远超过基因组学蛋白质组学研究对生物分析化学提出的挑战表11.1 目前蛋白质组学分析中使用的分离与鉴定技术6-12技术是否需要标记是否可用于PTM检测可测定的蛋白质分子量范围动态范围可分离的蛋白点数方法的适用范围传统的双向电泳方法（2-DE）否是10 kD200
4、kD1, 0003, 000定量困难，方法的重复性差荧光双向差示凝胶电泳（DIGE）Cy-2，3 or 5 fluorophores标记伯氨基是10 kD200 kD10, 00063, 0007适用于检测高表达水平、长半衰期的蛋白质基于反相色谱的二维色谱系统8否是5 kD的肽或蛋白质1002, 500限于UV检测，未与MS联用LC-MS/MS多维色谱系统(MudPit)可以用N14/N15标记氨基酸是蛋白质经酶解后的多肽混合物10, 000987210适用于较复杂的蛋白质混合物，进行MS分析前需进行分级分离MALDI-TOF-MS否是10 kD，实际测定蛋白质经酶解后的多肽混合物25不适用通
5、过肽质量指纹图鉴定已分离的蛋白质SELDI-TOF-MS11否是40 kD25不适用利用蛋白质芯片对生物样品中蛋白质的质量进行分析ICAT分析技术以ICAT试剂标记巯基是蛋白质经酶解后的多肽混合物无数据49612适用于含巯基蛋白质的相对定量分析cICAT分析技术以可裂解的C12/C13ICAT试剂标记巯基否蛋白质经酶解后的多肽混合物10, 000496适用于含巯基蛋白质的相对定量分析注：2-DE，双向电泳（two dimensional electrophoresis）；DIGE，荧光双向差示凝胶电泳（fluorescence two-dimensional differential gel
6、electrophoresis）；MudPit，用于蛋白质分离的多维色谱（multi-dimensional for protein identification）；SELDI-MS，表面增强激光解吸离子化质谱（surface enhanced laser desorption ionization-MS）；基质辅助激光解吸离子化质谱（MALDI-MS，matrix-assisted laser desorption ionization-MS）；ICAT，同位素标记的亲和标签(isotope-coded affinity tag)技术；cICAT，可裂解的ICAT（cleavable ICA
7、T）技术；PTM，蛋白质翻译后的修饰（posttranslational modification）。图11.2 蛋白质组学分析方法的灵敏度和分辨率13表11.1和图11.2表明，蛋白质组学研究对生物分析化学提出了很高的要求：（1）对含有巨大数量的多蛋白质成分的复杂体系进行全分离是蛋白质组学研究迫切需要解决的问题。（2）所建立的生物分析化学分离分析方法应具有很宽的动态范围，才能适应细胞内蛋白质组分析的要求。（3）蛋白质组学研究对检测灵敏度也提出了很高的要求。（4）原位、实时检测。（5）对蛋白质相互作用的检测是蛋白质组学研究中一个非常重要的内容，因此，发展基于生物化学的新的、重现性好的蛋白质相互
8、作用研究策略也是十分重要的。蛋白质组学的分析策略与研究路线蛋白质组学的基本分析策略图11.3 蛋白质组学分析的基本分析策略图11.4 鸟枪法的基本分析策略蛋白质组学的研究路线一条路线类似于基因组学的研究，即力图查清人类34万个基因编码的所有蛋白质，建立蛋白质数据库，从而获得有关生命活动的“全景式”信息。另一条是基于比较的研究路线，称为比较蛋白质组学（comparative proteomics），国外的文献中也有称为差异显示蛋白质组学（differential display proteomics）或表达蛋白质组学（expression proteomics）。图11.5 比较蛋白质组学分析的
9、研究路线双向电泳技术及其改进双向电泳（two dimensional electrophresis，2-DE）是当前蛋白质组学研究中分辨率最高、信息量最大的分离技术。在比较蛋白质组学研究中，双向电泳还是不可缺少的手段。目前所应用的二维电泳体系是由 OFarrell等人于 1957 年发明，其原理是根据蛋白质的两个一级属性（等电点和相对分子质量），将一种蛋白质样品进行两次电泳，即：在第一个方向上按等电点高低进行分离，称为等电聚焦；在第二个方向（与第一次电泳成直角的方向）上按相对分子质量大小进行分离。蛋白质组学研究中用得最多的是由固相pH梯度等电聚焦（immobilized pH gradient
10、s isoelectric focusing，IEF）/SDS-PAGE所构成的双向电泳体系。双向电泳的流程图11.6 双向电泳流程图19蛋白质样品的制备蛋白质样品制备的一般要求一般来说，一种理想的、有效的样品制备方法应满足以下要求：应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性；溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态，避免溶解性低的蛋白质(如膜蛋白)在等电聚焦时由于溶解度降低而沉淀析出；防止在样品处理过程发生蛋白质的化学修饰，包括蛋白质降解、蛋白酶或尿素热分解后所引起的修饰；排除核酸、多糖、脂类和其它干扰分子；同时，应避免处理环境对蛋白质的污染；
11、尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白在可检测水平；尽可能缩短处理样品的时间，尽可能在低温环境中处理样品。双向电泳图谱所传达的信息由双向电泳图可以得到：蛋白质的分布范围（偏酸性或偏碱性）；表达蛋白质的可能个数（凝胶点的数目）；蛋白质的大概相对分子量；蛋白质的大概等电点；蛋白质相对表达丰度（点的灰度值）等信息。图11.7 双向电泳例图23图像分析技术图像分析包括图像采集、背景消减、斑点配比、数据库构建。常用的图像采集系统有电感偶合装置（charge coupled devices，CCD）、光密度仪、激光诱导荧光检测器等。无论何种采集系统，都必须具备透射扫描的功能以获得较高的灵
12、敏度。图像采集的信息为光密度值，一般来说，该光密度值与蛋白质点的表达丰度成正比。影响图像采集质量的因素有：扫描系统的分辨率、灵敏度，以及扫描时所选择的图像对比度和明亮度。双向电泳图像分析通过软件的运行来实现。软件分析所要做到的有以下几点：蛋白质点数的统计；蛋白质点的定位、编号；相对丰度分析；在进行差异蛋白质组分析时，则要对相互对照样品的凝胶图像进行同步分析，比较对应蛋白点的表达丰度，获得差异蛋白质点的缺失、出现以及表达量的变化等信息。目前有多种图像分析软件可以使用，如表11.6所列。表11.6 用于2-DE图像分析的软件工具软件名称来源应用FlikerNational Cancer Insti
13、tute（www.lecb.ncifcrf.gov / fliker/）可视的胶-胶对比PDQuestBio-Rad（）凝胶图像比较Image MsterAmersham Biosciences（）凝胶图像比较DeCyderAmersham Biosciences（）2D-DIGE分析MelanieGenebio（http: / www. Dynamics（http: / www. HT AnalyzerGenomic Solutions（http: / www. WeawerDefiniens（http: / www. 2DDecodon（http: / www. 2D-DIGE：
14、荧光双向差示凝胶电泳目前双向电泳技术存在的问题（1）进行可完全重复的2-DE分析是困难的。（2）许多较大的疏水蛋白质在IEF分析中的结果不理想。（3）对相对分子质量过大（100, 000）的蛋白质分离分析能力差。（4）双向电泳不易实现自动化操作，因此，尚不能适应大规模蛋白质组分析的需要。（5）双向电泳现有的主要染色技术的检测灵敏度较差。图11.8 目标蛋白拷贝数与胶上荷载的由细胞提取的蛋白质量的关系24双向电泳技术的改进目标主要有两个：提高分辨率，增加可分离的蛋白点的数目；提高低丰度蛋白点的可检出程度。11. 4. 5. 1 三步提取法图11.9 三步提取法流程图11. 4. 5. 2 亚细胞器分离优点为：增加了蛋白的点分离数量；可提高低丰度蛋白的检出；可明确蛋白点的亚细胞定位。图11.10 肝癌细胞QGY-7703全细胞及细胞核、20000 g沉淀、100, 000 g沉淀、细胞质的双向电泳图荧光双向差示凝胶电泳技术（fluorescence
