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1、长链非编码RNA MEG3对胃癌细胞增殖的影响研究摘 要目的:探讨长链非编码RNA MEG3在胃癌组织及细胞系中的表达水平，以及过表达MEG3对胃癌 细胞增殖能力的影响，并探索其可能的作用机制。方法:用定量PCR (qRT-PCR)技术检测胃癌组织及细胞 系中MEG3的表达水平；通过转染pCDNA-MEG3上调MEG3的表达水平，并通过qRT-PCR检测转染效 率。用MTT和克隆形成实验检测上调MEG3的水平对BGC-823细胞和MGC-803细胞的增殖能力的影响， 用Western blot实验检测这两种细胞中上调MEG3的水平对p53蛋白的表达水平的影响。结果:相比正常胃 组织及细胞，在胃
2、癌组织和细胞中MEG3的表达出现显著下调，SGC7901、MGC-803和BGC-823细胞中 MEG3的表达水平分别是正常胃上皮细胞GES-1中的73.6 %、42.0 %和27.1 % (p0.05)。BGC-823细胞 和MGC-803细胞中转染pCDNA-MEG3能显著上调MEG3的表达，MEG3的表达水平分别为对照组的252 倍和311倍(p0.05)； MTT和克隆形成实验显示，上调MEG3的表达能降低BGC-823细胞和MGC-803 细胞的增殖能力。Western blot实验显示，转染了 pCDNA-MEG3的MGC-803和BGC-823细胞中p53的表 达相较对照组中显著
3、增加。结论:胃癌组织及细胞中MEG3的表达下调，且这可能通过抑制p53蛋白的激活 从而促进胃癌细胞增殖，影响胃癌的发生和发展。关键字胃癌；长链非编码RNA； MEG3；细胞增殖；p53Down-regulated long noncoding RNA MEG3 promotes cell proliferation in gastric cancerAbstract Objective: To investigate the expression level of long noncoding RNA MEG3 in gastric cancer tissues and cell lines,
4、 and to study the effect of up-regulation of MEG3 expression on gastric cancer cells proliferation and its possible mechanism. Methods: Quantitative reverse-transcription PCR was performed to detect the relative expression of MEG3 in gastric cancer cell lines and tissues. pCDNA-MEG3 was transfected
5、into BGC-823 cells and MGC-803 cells to down-regulate MEG3 expression, and quantitative reverse-transcription PCR was used to test the transfection efficiency. MTT and colony formation assays were performed to detect the effect of MEG3 on gastric cancer cells proliferation. Western blot assay was us
6、ed to test the expression level of p53 protein in MGC-803 cells and BGC-823 cells transfected with pCDNA-MEG3 respectively, compared to those with empty vector. Results: This study showed that MEG3 was lowly expressed both in gastric cancer samples and cell lines compared with their corresponding no
7、rmal tissues and cell lines. The expression level of MEG3 in SGC7901, MGC-803 and BGC-823 cells were 73.6 %, 42.0 % and 27.1 % of that in normal gastric epithelium cell GES-1, respectively (p0.05). Transfection of pCDNA-MEG3 could significantly increase its expression in BGC-823 cells and MGC-803 ce
8、lls respectively, 252 and 311 folds compared with control cells (p0.05). MTT and colony formation assays indicated that up-regulated MEG3 could inhibit BGC-823 and MGC-803 cells proliferation. Western blot assay showed that the expression level of p53 protein was significantly increased in MGC-803 c
9、ells and BGC-823 cells transfected with pCDNA-MEG3 compared with those with empty vector, respectively. Conclusion: Down-regulated MEG3 could promote gastric cells proliferation, probably by inhibiting the activation of p53, and thus affect the development and progression of gastric cancer.Keywords
10、gastric cancer; long noncoding RNA; MEG3; cell proliferation; p53胃癌是导致全球癌症相关死亡的第二大恶性肿瘤，近年来其发病率呈上升趋势，每年约 有一百万新发病例，其中50%的病例发生在东亚地区（主要在中国）1。胃癌早期临床症状 不典型，确诊的患者多以进展期胃癌为主，常伴有淋巴结转移和腹腔内侵袭、转移，因此胃 癌患者治疗效果不佳、预后差，5年生存率低于10%24。因此，更好地理解胃癌的发病机 制以及分子水平的变化对发展生物诊断标志物至关重要，这些标志物能帮助提供新的有效的 胃癌治疗手段。长链非编码RNA （long noncodin
11、g RNA， IncRNA）是一类在基因组转录中不参与编码 蛋白、长度超过200nt的转录产物。它具备多种生物学功能，并在染色质修饰、转录、翻译、 剪接、表观遗传学调控等多种生物进程中发挥重要作用。研究证实，IncRNA的变异和调 节异常能够导致包括肿瘤在内的多种疾病。因此确定癌症相关的IncRNA并研究其分子和 生物学功能对理解肿瘤分子生物学及其进展十分重要。母系表达基因3 （Maternally expressed gene 3, MEG3）是位于染色体14q32的肿瘤抑制 基因，其编码产物非编码RNA（noncoding RNA, ncRNA）与肿瘤发生有关阻 MEG3 RNA在许多正常
12、组织中表达，但其在许多人类原发性肿瘤中表达缺失，包括神经胶质瘤、 肝细胞肝癌、脑膜瘤和膀胱癌9-12】。在人神经胶质瘤细胞系中，MEG3过表达能够诱导细胞 生长停滞并促进细胞凋亡9】。但是，目前对MEG3在胃癌中的表达水平和在胃癌致病机制中 的生物学作用知之甚少。本研究旨在阐明IncRNA MEG3在胃癌中的表达情况，探索MEG3水平变化对体外胃癌 细胞表型的影响。本研究进一步希望为胃癌预后提供的新标志物，为胃癌干预治疗提供新的 靶标。1材料与方法1.1组织收集36例样本来自于江苏省人民医院2006-2008年间被诊断为胃癌并接受手术的患者，这 些样本经过病理科严格鉴定（分期II, III,
13、IV;美国癌症联合会癌症分期指南第七版）。在手 术前所有患者均未接受过局部或全身治疗。所有样本取下后立即液氮冷冻，在提取RNA之 前，一直置于-80 C环境中冻存。本研究由南京医科大学伦理委员会通过，并取得所有患者 的知情同意书。1.2细胞系和培养条件三种胃癌细胞系（SGC7901，MGC-803和BGC-823）以及胃粘膜上皮正常细胞系GES-1 购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。细胞用高糖DMEM、含有10% FBS、100 U/mL青霉素以及100 mg/mL链霉素的培养基于37 C,含5% CO2的潮湿恒温培养箱中常 规培养。每1-2天更换新鲜培养基，当细胞融合度达到80%-9
14、0%时进行传代培养。1.3 RNA提取和定量反转录PCR （ qRT-PCR）使用TRIzol试剂（购自美国的Invitrogen公司）提取组织或培养的细胞中的总RNA。 使用反转录盒（购自大连的Takara公司）将RNA反转录为cDNA。使用Power SYBR Green （购自大连的Takara公司）做实时PCR分析。结果用GAPDH的表达量标准化。MEG3的 PCR 引物： 上游引物：5-CTGCCCATCTACACCTCACG-3， 下游引物： 5-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3 ； GAPDH 上 游 引 物： 5-GTCAACGGATTTGGTCTGTAT
15、T-3，下游引物：5-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3。 qRT-PCR和数据收集基于ABI 7500平台。MEG3相对于GAPDH的表达使用2“Ct法计算 和标准化。1.4质粒的构建MEG3序列被合成和亚克隆至pCDNA3.1载体（购自上海的Invitrogen公司）。通过使 用pCDNA-MEG3转染实现MEG3的异常表达，使用空的pCDNA载体作为对照。使用qPCR 检测MEG3的表达水平。1.5胃癌细胞转染所有用于转染的质粒载体（pCDNA-MEG3和空载体）经DNA Midiprep或Midiprep盒 （购自德国的QIAGEN公司）提取。按照使用说明书通过Lipofe
16、ctamine 2000 （购自上海的 Invitrogen公司）将pCDNA-MEG3或空载体转染至六孔平板上培养的胃细胞上。48h后收 集细胞用于qRT-PCR和 Western blot分析。1.6细胞增殖实验本研究使用MTT试剂盒（购自美国的Sigma公司）并按其使用说明进行细胞增殖实验。 对于克隆形成实验，在含有10% FBS的六孔板中，每孔加入500个细胞，保存两周。集落 用甲醇固定并用0.1%的结晶紫在PBS中染色15分钟。通过用倒置显微镜取三个随机视野 观察来判断集落形成情况。每个处理组一式三份。1.7 Western blot 实验对细胞蛋白溶解物进行10%的SDS-PAGE实验，将蛋白转到NC膜（Sigma公司）上, 并用特定抗体孵育。通过放射密度测定法（Quantity One software，Bio-Rad）对放射自显影 图片进行量化。GAPDH作为对照。抗p53抗体（1:1000）购自Cell Signal
