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1、临床分离产头孢菌素酶阴沟肠杆菌的耐药性研究【关键词】 临床摘要 目的：研究我院产头孢菌素酶（AmpC酶）阴沟肠杆菌的检出率、耐药情况及ampC基因型。方法：收集临床分离的耐药阴沟肠杆菌15株；三维试验检测AmpC酶；NCCLS方法检测超广谱内酰胺酶（ESBLs）；琼脂二倍稀释法测定MIC值；PCR扩增检测ampC基因及序列测定。结果：15株菌中8株菌（53.3%）产AmpC酶，3株菌（20.0）产ESBLs。产AmpC酶的菌株除对亚胺培南全敏感外，对其它抗菌药不同程度耐药。5株菌的ampC基因与阴沟肠杆菌ECLC074的ampC基因100同源，3株菌与之99同源，2株菌的AmpC酶发生了1个氨
2、基酸残基的改变。结论：产AmpC酶是阴沟肠杆菌对内酰胺类抗生素耐药的主要机制之一。阴沟肠杆菌ECLC074 ampC基因是我院主要的阴沟肠杆菌ampC基因型。产AmpC酶的阴沟肠杆菌常呈多重耐药，亚胺培南是治疗此类菌所致感染的最有效药物。 关键词 阴沟肠杆菌；头孢菌素酶；ampC基因；耐药 阴沟肠杆菌是一种重要的条件致病菌，随着新的内酰胺类抗生素广泛应用于临床，此类菌的耐药问题越来越受到人们的关注。细菌通过产生大量的由染色体或质粒介导的内酰胺酶（Bla）可使抗生素失活，包括头孢菌素酶（AmpC酶）、超广谱内酰胺酶（ESBLs）、碳青霉烯酶等。AmpC酶由ampC基因编码，常见于阴沟肠杆菌、枸橼
3、酸杆菌、摩根摩根菌、粘质沙雷氏菌等。为明确本地区医院感染阴沟肠杆菌的耐药机制，指导临床合理使用抗菌药，本文对产AmpC酶的阴沟肠杆菌的耐药表型和ampC基因进行初步研究。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株 川北医学院附属医院2003年2月至2004年1月分离的耐哌拉西林阴沟肠杆菌15株，经梅里埃vitek 32细菌鉴定系统鉴定。E. coli JM109由四川大学华西基础医学与法医学院感染免疫研究室提供。标准质控菌株大肠埃希氏菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603由四川抗菌素工业研究所提供。1.1.2 主要试剂 哌拉西林（齐鲁制药厂），哌拉西林/他唑巴坦（上海先锋药业公
4、司），头孢哌酮、头孢哌酮/舒巴坦（哈药集团制药总厂），头孢他定、头孢噻肟（哈尔滨誉衡药业有限公司），氨曲南、头孢吡肟（中美上海施贵宝制药有限公司），亚胺培南（美国默沙东药厂），头孢西丁(海南轻骑海药股份有限公司)，AMK (江苏吴中实业股份有限公司)，加替沙星(南京圣和药业赠)，环丙沙星（中国药品生物制品检定所）。头孢他定/克拉维酸纸片、头孢他定纸片、头孢噻肟/克拉维酸纸片/头孢噻肟纸片、头孢西丁纸片购于北京天坛药物生物技术开发公司。DNA凝胶回收试剂盒购于Vgene生物技术有限公司。基因组小量抽提试剂盒购自上海Sangon生物工程技术有限公司。pMD 18T Vector购于TaKaRa公司
5、。1.1.3 主要仪器 Sakuma MITP细菌多点接种仪，MJ Research PTC150型PCR仪，GDS2000多功能凝胶成像和分析系统。1.2 方法1.2.1 Bla粗提液的制备及Bla的定性检测 超声破碎法制备，Nitrocefin进行酶的定性检测。1.2.2 AmpC酶的检测 通过三维试验1判断是否持续高产AmpC酶。1.2.3 ESBLs酶的检测 根据2002年NCCLS的规定进行。1.2.4 药敏试验 采用琼脂二倍稀释法 。根据2002年NCCLS的标准判断。1.2.5 基因组DNA的提取 使用基因组小量抽提试剂盒，按说明操作。1.2.6 设计引物及PCR扩增检测ampC
6、基因 根据已知的阴沟肠杆菌ampC基因序列，设计引物P1: 5gactcgctattacggaag3P2: 5ttactgtagcgcctcgag3引物由上海Sangon生物工程技术有限公司合成。以基因组DNA为模板扩增ampC基因。PCR扩增条件为： 94 3 min，55 1min，72 1min，共30个循环，最后72延伸 7min。扩增产物进行1琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.7 ampC基因PCR产物的回收、TA克隆及重组质粒的酶切鉴定 PCR扩增产物经1琼脂糖凝胶电泳，切下目的带，用DNA凝胶回收试剂盒回收DNA。取3l回收DNA与含氨苄西林抗性基因的pMD 18T Vector连接，
7、连接反应液转化至经氯化钙制备的E. coli JM109感受态细胞，经含氨苄西林的LB培养基进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落，过夜培养后，提取质粒经EcoRI和 Hind双酶切鉴定。1.2.8 扩增产物的序列测定及同源性分析 转化菌送上海基康生物公司进行DNA测序，测序结果在GenBank上用BLAST进行同源性检索分析。2 结果2.1 Bla的定性检测 所试菌均产Bla。2.2 AmpC酶的检测结果 所试菌中8株菌持续高产AmpC酶,检出率为53.3。2.3 ESBLs的检测结果 所试菌中3株（20.0）产ESBLs，8株产AmpC酶的细菌均不产ESBLs。2.4 MIC测定结果 8株产AmpC
8、酶的细菌对第三代头孢菌素、头孢西丁及氨曲南完全耐药，对哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟的耐药率分别为25.0、50.0、50.0，对亚胺培南无耐药株，1株菌对阿米卡星耐药，1株菌对环丙沙星及加替沙星敏感（表1）。表1 抗菌药对8株产AmpC酶阴沟肠杆菌的抗菌活性（略）2.5 PCR扩增检测ampC基因 产AmpC酶的8株菌扩增出约1100bp的阳性扩增带（图1）。图1 8株阴沟肠杆菌ampC基因PCR产物电泳图（略）2.6 ampC基因核苷酸序列及氨基酸序列分析 扩增产物经TA克隆后测序得知，8株菌的ampC基因为1146bp，与阴沟肠杆菌ECLC074的ampC基因核苷酸序列(
9、1146bp, 注册号AY536040)及氨基酸序列对比分析（图2），5株菌与其核苷酸序列100同源，其余3株菌与其核苷酸序列99同源。其中，阴沟肠杆菌351的 ampC基因核苷酸序列发生了5个位点的同义突变；阴沟肠杆菌394 的ampC基因核苷酸序列在506位发生TC的异义突变；阴沟肠杆菌3107的ampC基因核苷酸序列发生了2个位点的同义突变和1个位点的异义突变（表2）。图2 阴沟肠杆菌ECLC074AmpC酶的氨基酸序列（略） 表2 Ecl351、Ecl394、Ecl3107与ECLC074的ampC基因及AmpC酶的差异性核苷酸（略）3 讨论 AmpC酶属Bush1型Bla，能水解第三
10、代头孢菌素，不被克拉维酸抑制。一般情况下，阴沟肠杆菌未接触内酰胺类抗生素时，AmpC酶呈低水平表达，但能在具有诱导力的内酰胺类抗生素（尤其是IMP、FOX）的作用下诱导产生；也可因调控基因ampR、ampD等高自发性突变使ampC基因去阻遏，从而持续大量的产生2。近年来法国、美国3、巴西4等西方国家报道了由产ESBLs阴沟肠杆菌引起的医院感染，从而说明产生ESBLs是造成该类菌对内酰胺类抗生素耐药的另一重要原因。本实验中，产AmpC酶菌的高检出率（53.3）说明产AmpC酶是本地区医院感染阴沟肠杆菌对内酰胺类抗生素耐药的主要机制。3（20.0）株菌产ESBLs，可见产生ESBLs是该类菌的另一
11、耐药机制。8株产AmpC酶阴沟肠杆菌的ampC基因与阴沟肠杆菌ECLC074的ampC基因高度同源，说明本院产AmpC酶阴沟肠杆菌的ampC基因起源于阴沟肠杆菌ECLC074的ampC基因，此基因是该类菌的主要基因型，携带此基因的阴沟肠杆菌可能在院内流行。与阴沟肠杆菌ECLC074的AmpC酶氨基酸序列相比，2株阴沟肠杆菌的AmpC酶发生了1个氨基酸残基的变异，但丝氨酸Bla所共有的活性结合位点SXXK5，AmpC酶的特征性结构YXN、KTG6以及Thr707均未发生变化。要明确AmpC酶氨基酸残基的变异是否影响其水解底物的活性，有待进一步探明。 药敏试验显示产AmpC酶阴沟肠杆菌对哌拉西林/
12、他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟、亚胺培南以外的内酰胺类抗生素完全耐药。以往认为第四代头孢菌素头孢吡肟可用于治疗高产AmpC酶细菌引起的感染，但本实验发现50.0该类菌对头孢吡肟耐药，耐药机制显然与高产AmpC酶有关。AmpC酶对内酰胺酶抑制剂不敏感，而实验中内酰胺酶抑制剂不同程度降低了产AmpC酶阴沟肠杆菌的耐药率，未发现此类细菌产ESBLs，说明部分细菌同时产生对内酰胺酶抑制剂敏感的其它Bla如广谱酶、青霉素酶等。对亚胺培南无1菌株耐药提示碳青霉烯类抗生素在治疗高产AmpC酶菌引起的感染中发挥着重要的作用。阿米卡星对产AmpC酶阴沟肠杆菌的耐药率为12.5，显示阿米卡星是治疗该类细菌所
13、致感染的有效药物，此和国内的其它实验报道一致8,9。产AmpC酶阴沟肠杆菌对FQNS呈现高度耐药，表明该类细菌同时存在耐FQNS的机制，其机制是细菌DNA螺旋酶的改变、外膜渗透性降低或是药物的主动外排，需进一步探讨。由此可见，多重耐药现象、多种耐药机制普遍存在于阴沟肠杆菌，给临床治疗带来了困难。因此临床医生应提高警惕合理使用抗菌药，以有效治疗及控制耐药菌的感染并延缓新型耐药菌的出现及扩散。参考文献1 Coudron PE, Moland ES, Thomson KS. Occurrence and detection of AmpC betalactamases among Escherich
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