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1、凋膜止崩方对大鼠增生子宫内膜中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响周 燕 ，贺丰杰（陕西中医学院国家中医药管理局（妇科重点学科），陕西 咸阳 712046）摘 要 目的:探讨凋膜止崩方靶向干预前后凋亡调节基因Bcl-2和Bax在大鼠增生子宫内膜组织中的表达情况。方法:建立大鼠增生型子宫内膜模型，设立空白组（A）、模型对照组（B）、实验大剂量组（C）、实验小剂量组（D）,并进行相应的处理。采用Western-blot方法检测四组大鼠子宫内膜组织中bcl-2和bax蛋白的表达。结果:动情前期A组bcl-2表达较低,B组表达较高；且A组与B组、B组与C、D组之间差异有统计学意义（P0.05）。而动情前期
2、A组bax表达较高,B组表达则较低;且A组与B组、B组与D组之间差异有统计学意义（P0.05）。在A组和B组中,bcl-2与bax表达均呈显著负相关。结论:凋膜止崩方通过降低大鼠增生子宫内膜中bcl-2蛋白表达，增高bax蛋白表达,从而加速了子宫内膜中细胞凋亡过程,达到祛除大鼠增生过长子宫内膜作用。 关键词：凋膜止崩方; Bcl-2 ;Bax ;增生子宫内膜组织;Western-blot The Influence of The diaomozhipeng Prescription on The Expression of Bcl-2 and Bax in Hyperplastic Endom
3、etrium of Rats基金项目：国家自然科学基金资助项目（NO.30873354） 陕西省“13115”科技创新工程重大科技专项（2008ZDKJ-81）通讯作者：E-mail 【Abstract】 Objective: The paper investigates the expression changes of Bcl-2 and Bax, after the diaomozhipen prescription is used to target the hyperplasia endometrium of rats. Methods: The rats were divided
4、into four groups, they were the normal contrasting group (A), the model group (B), the higher dosage group (C), the lower dosage group(D), The models of hyperplastic endometrium of rats were established , and the rats were treated accordingly in all groups. The expressions of Bcl-2 and Bax were dete
5、cted by western-blotting in all groups. Results: In preoestrus, the expression of Bcl-2 in group A is lower and the expression of Bcl-2 in group B is higher. For expression of Bcl-2, group A has significant difference with group B (P0.05), and group B has significant difference with group C and grou
6、p D, respectively (P0.05). And In preoestrus, the expression of Bax in group A is the higher and the expression of Bax in group B is the lower. For expression of Bax, group A has significant difference with group B (P0.05), and group B has significant difference with group D (P0.05). The expression
7、of Bcl-2 has negative correlation with the expression of Bax in both group A and group B. Conclusion: The diaomozhipen prescription can dispel the extreme hyperplastic endometrium of rats, and weaken the expression of Bcl-2 while enhance the expression of Bax. Moreover, the apoptosis of endometrium
8、cell is accelerated.【Key words】Diaomozhipeng Prescription; Bcl-2 ; Bax ;Hyperplastic Endometrium; Western-blot功能失调性子宫出血(Dysfunctional Uterine Bleeding，DUB)简称功血,是妇科常见病。按发病机制的不同,功血可分为排卵型和无排卵型两类,以无排卵型功血(anovulatory dysfunctional uterine bleeding，ADUB)为主(约占85%)。它是一种良性增殖性病变,但是到目前为止,其出血机制尚未完全阐明。有研究表明，功血的子
9、宫内膜存在细胞凋亡的发生,并且良性增殖性病变子宫内膜的凋亡指数（AI）高于正常增殖期1-2。这种AI的增加,显示了良性增殖性病变子宫内膜中细胞凋亡对细胞过度增生的代偿作用3。在细胞凋亡过程中有多种促凋亡基因、抑凋亡基因(例如:bcl-2bax)和胞内信使参与调节,其中bcl-2基因族所起的作用愈来愈受到重视4。中医无功能失调性子宫出血的病名,依据其月经过多,月经频发,子宫不规则出血的临床表现,ADUB相当于中医学 “崩漏”的范畴。治疗应以止血、化瘀为主。凋膜止崩方由鸦胆子、莪术、三棱三味药物组成,医学衷中参西录中说:鸦胆子,性善,凉血止血,兼能化瘀生新。方中莪术、三棱是传统的破血化瘀消癥中药,
10、 逐瘀去旧血力量较强。临床多用于瘀滞气结、瘀血结块等症。本课题通过检测不同剂量凋膜止崩方作用后凋亡调节基因Bcl-2和Bax在大鼠增生子宫内膜组织中的表达情况,从中医药对调节bcl-2、bax表达的影响出发进行研究,为临床治疗ADUB的新方法-中药靶向干预子宫内膜增生症提供理论依据。材料与方法一、药物与试剂凋膜止崩方,由鸦胆子、莪术、三棱三味药物组成。所用药物由陕西中医学院药学系提供,经生药学鉴定，符合中国药典2005年版规定的质量标准。提取有效部位群（方中的鸦胆子提取鸦胆子油、莪术提取莪术油）。根据前期实验，按照提取物:乳化液:生理盐水=1:1:8的比例加入吐温-80和生理盐水,配成乳化剂。
11、用药剂量按照人:大鼠=6.25:1的比例给予。兔抗鼠bcl-2多克隆一抗、兔抗鼠bax多克隆一抗均为美国santa cruz公司的产品;辣根过氧化酶标记羊抗兔二抗、-actin、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒均为博士德生物技术有限公司产品。二、实验动物与分组1、种属：健康成年SD雌性大鼠,48只,鼠龄50-60天,体重20020g,购自于西安交通大学动物实验中心,批号2007-001。尽量选择同一批出生并在一起饲养的大鼠,以确保它们的性周期一致。2、分组：将实验动物随机分为4组,A组:12只,空白组（假手术组）;B组:12只,模型对照组,去势手术+体内雌激素诱导;C组
12、:12只,实验大剂量组;D组:12只,实验小剂量组。三、方法1、大鼠子宫内膜过度增生模型的建立 将购回的大鼠每5只一笼,适应性喂养3天,随机分成A、B、C、D四组。A组:仅按照手术操作开关大鼠腹部而不摘除卵巢。术后连续肌注青霉素3天,预防感染。术后第3天起肌注高压灭菌花生油,隔天注射,连续7次,观察大鼠阴道涂片,于阴道涂片显示处于动情前期时处死。B组（制造大鼠子宫内膜过度增生模型,类似于人ADUB的子宫内膜组织）:手术摘除大鼠双侧卵巢,术后注意护理,伤口涂抹红霉素软膏,同时肌注青霉素连续3天,预防感染。术后第3天起肌注苯甲酸雌二醇,隔天注射,连续14次后,给大鼠双侧宫腔内注射生理盐水0.3ml
13、,于宫腔注射生理盐水后第三天,病理切片证实为子宫内膜过度增生后处死（见图1）。C、D组:手术摘除大鼠双侧卵巢,术后注意护理,伤口涂抹红霉素软膏,同时肌注青霉素,连续3天,预防感染。术后第3天起肌注苯甲酸雌二醇,隔天注射,共计4周后,分别给C组动物双侧宫腔内注射大剂量实验用药（鸦胆子油、莪术油、三棱混合液）0.6ml（即0.3ml/侧，药物含量0.001/侧）,D组动物双侧宫腔内注射小剂量实验用药（鸦胆子油、莪术油、三棱混合液）0.6ml（即0.3ml/侧，药物含量0.0005/侧）于宫腔注药后第三天处死。各组大鼠均于处死后取出子宫组织，-20保存备用。空白组（100） 空白组（100） 模型组
14、（100） 模型组（200）图1 模型对照组子宫内膜过度增生光镜组织学特征HE染色显示, 空白组大鼠子宫内膜上皮细胞完整,腺体散在,腺腔小,腺上皮细胞呈立方,间质疏松;模型组大鼠子宫内膜上皮完整,腺体数量明显增多,拥挤,相邻腺体有背靠背现象,腺上皮有假复层现象,腺上皮细胞呈高柱状。2、Western-blot方法检测Bcl-2、Bax 蛋白表达水平 （1）用蛋白裂解液提取大鼠子宫组织（因大鼠子宫内膜组织非常薄,很难与肌层分离,且bcl-2在大鼠子宫肌层有稳定表达5,故取全层）中的总蛋白,通过BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度测定。（2）将提取蛋白煮沸变性后取80ug上样到SDS-PAGE胶加样孔
15、内进行电泳,PVDF膜恒流转膜。（3）将蛋白膜置于5%脱脂奶中（用PBST配制）封闭1h,用PBST液洗膜5min2次。稀释兔抗鼠bcl-2多克隆抗体、兔抗鼠bax多克隆抗体（1:200）,滴加一抗于蛋白膜上,室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育1h,置于4冰箱中过夜。（4）用PBST洗膜3次,每次20min,将膜放于培养皿中,稀释辣根过氧化酶标记羊抗兔二抗（1:1000）,滴加二抗于蛋白膜上,用保鲜膜封闭培养皿,室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育1h。（5）去掉保鲜膜,取出PVDF膜,在PBST溶液中冲洗3次,每次10min。用Western Blotting luminol reagent中A液和B液等
16、体积混合,滴加于膜上,均匀覆盖PVDF膜,暗室静置1min,采用Bio-Rad凝胶成像系统进行图像采集。用Quantity One软件分析条带光密度值,以目的条带与内参灰度值之比作为衡量参数,分析bcl-2、bax蛋白的相对表达。四、统计学处理结果采用SPSS17.0软件包进行统计分析,数据用s表示。组间比较采用配对t检验,指标间相关性分析,采用直线相关分析,P0.05有统计学意义。结 果一、各组大鼠子宫内膜组织中Bcl-2表达情况模型对照组与空白组比较,子宫内膜组织中Bcl-2蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义（P0.05）;实验小剂量组、实验大剂量组与空白组比较,子宫内膜组织中Bcl-2蛋白表达水平变化不大,而与模型对照组比较,子宫内膜组织中bcl-2蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义（P0.05）,
