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1、外泌体提取详细步骤及方法1、差速离心差速离心仍然是最常见的外泌体分离技术之一。该方法包括几个步骤，包括低 速离心去除细胞和凋亡碎片；更高速离心以消除更大的囊泡；最后高速离心沉 淀外泌体：300xg离心10分钟，取上清。2000xg离心10分钟，取上清。10, 000xg离心30分钟，取上清。100, 000xg，在4C下持续离心90分钟， 去掉上清，留下的沉淀PBS重悬后，再次以100，000xg离心90分钟。2、密度梯度离心该方法将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，实现外泌体与非囊泡颗粒分离，例 如蛋白质和蛋白质/RNA聚集体。因此，该方法将囊泡与不同密度的颗粒分 开，能够提取含量低的外泌体。但
2、是，合适的离心时间非常重要，否则如果它 们具有相似的密度，则仍可在外泌体中发现污染颗粒。3、尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱(Size-exclusion chromatography， SEC )是基于大小而非分子量实 现分离大分子。该技术应用填充多孔聚合物微球的柱子，分子根据其直径通过 微球，半径小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱的孔隙迁移，而大分子则 从色谱柱中更早地洗脱。尺寸排阻色谱可以精确分离大小分子。此外，可以 将不同的洗脱溶液应用于该方法。与离心方法相比，色谱分离已被证明具有更 多优势，因为通过色谱分离的外泌体不受剪切力的影响，这可能会改变囊泡的 结构。目前，SEC是一种广泛接受的分离
3、血液和尿液中外泌体的技术。不 过，该方法耗时较长，不适合大量样本处理。4、过滤超滤膜也可用于分离外泌体。根据外泌体的大小，从蛋白质和其他大分子中分 离外泌体。最常见的过滤膜具有0知m、0.45叩或0.22叩的孔径，可用于收 集大于800nm、400nm或200nm的外泌体，也有设计成微柱多孔硅纤毛结构以 分离40-100nm外泌体：不过，该方法由于过滤膜的粘附，可能会损失外泌 体，并且过滤时的压力和剪切力，可能会使外泌体变形受损。5、基于聚合物的沉淀技术基于聚合物的沉淀技术通常包括将样本与含聚合物的沉淀溶液混合，在4C温 育并低速离心。用于聚合物沉淀的最常见聚合物之一是聚乙二醇(PEG)。用这
4、种聚合物沉淀具有许多优点，包括对分离的外泌体影响小、pH中性等。目前 大多数快速分离外泌体的商品化试剂盒都是基于此方法。然而基于聚合物的沉 淀方法可能会同时分离非囊泡污染物（包括脂蛋白）而且，聚合物材料的混杂 可能会影响下游分析。6、免疫分离技术免疫分离外泌体的原理大多是通过抗体包被的微球，特异性结合外泌体。例如 使用抗肿瘤相关HER2和EpCAM的抗体从肿瘤细胞中分离出肿瘤来源的外泌 体。然而，使用抗体包被珠子的分离不适合从大量样本中获得外泌体。还有将抗体包被于ELISA中的那种板上面，直接分离后检测、分析、定量。最 近的一项研究已应用免疫亲和超顺磁性纳米粒子（ISPN）来结合外泌体，研究 人员通过连接抗CD63抗体和纳米粒子生成ISPN，并用它们从体液中分离外泌 体。7、通过筛分分离该技术利用压力或电场，通过膜从样本中筛出外泌体：该方法分离时间短，可 以提供较高纯度的外泌体。但是回收率低。Cells Dad cefc- Cel debris
