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1、摘要： psbA基因编码的D1蛋白是光系统（PS）的重要组成部分，参与维持PS反应中心构象的稳定和电子的传递。以耳叶苔科植物的psbA基因序列作为研究材料，通过预测耳叶苔科各物种间的分化时间，推测可能影响其进化的外部因素；应用位点模型、分支模型、分支位点模型以及FEL模型对psbA基因进行适应性进化分析，检测可能受到正选择的位点，为D1蛋白的结构和功能研究提供参考信息。研究结果显示耳叶苔科植物最早的分化发生在距今约121Ma年前，进入新生代分化速度明显加快，推测与被子植物的兴盛有关；通过适应性进化分析，在D1蛋白中检测到4个正选择位点，30个高度保守的位点，研究结果再一次验证了psbA基因高度
2、保守的特性。关键词：耳叶苔科；psbA基因；分歧时间；适应性进化； Divergence Time Estimation and Adaptive Evolution Analysis of FrullaniaceaeAbstract: D1 protein encoded by psbA gene is an very important component of Photosynthesis System (PS) and contributes to the stability of PSs reaction center and electron transfer. The diver
3、gence time is estimated using psbA gene of Frullaniaceae, the adaptive evolution of psbA gene is also analyzed under site model, branch model, branch-site model and FEL model, respectively. The result shows that the first divergence event happened about 121Ma ago, the speed of divergence accelerated
4、 after Cenozoic; Four sites were founded under positive selection while thirty sites under negative selection and no site was founded to experienced coevolution. The result of our research is another evidence of the highly conservative of psbA gene.Key words: Frullaniaceae; psbA gene; divergence tim
5、e; adaptive evolution; coevolution 在相当长的一段时间里，人们普遍认同这样一种观点：白垩纪被子植物的兴起伴随着包括蕨类植物在内的众多非种子维管植物多样性和丰富度的急剧下降。Schnelder等基于化石记录利用分子钟重新估算了被子植物和蕨类各自的分化时间，研究结果表明现存的绝大多数蕨类植物的分化发生在白垩纪被子植物繁盛之后，即蕨类在适应由被子植物提供的新的生境的过程中发生了物种的“辐射式”增长。之后对水龙骨科附生蕨类rbcL基因的适应性进化分析表明蕨类植物的确可以通过功能基因的进化达到适应外界新环境的目的。苔藓植物是一类与蕨类具有相似起源与进化历史的植物类群，对
6、蕨类的研究结果提示我们苔藓植物在进化过程中极有可能也经历了类似的物种快速分化的阶段。耳叶苔科（Frullaniaceae）是苔类植物中较大的一科，包括毛耳苔属（Jubula）和耳叶苔属（Frullania）。现存的耳叶苔科植物约有800多种 1-2 ，主要分布于热带、亚热带地区，其生活方式以附生为主。由于在水分、光照等方面存在较大差异，推测耳叶苔科各物种在进化过程中相关的功能基因会发生适应性进化，尤其是与光合作用相关的基因。 光系统（PS）定位于叶绿体的基粒类囊体膜上，是光反应“Z”链上的第一个蛋白-色素复合体，同时也是自然界中唯一一个能将水分子分解成氢和分子氧的复合体。PS主要负责光能的吸收
7、、传递和转化，在光合作用过程中发挥重要作用。 psbA基因编码的D1蛋白是构成PS反应中心的核心蛋白之一，与D2蛋白共同构成了PS的基本骨架；D1蛋白也是PS中一个重要的功能蛋白亚基，直接能与了光合作用过程中原初电荷的分离与电子传递，因此，D1蛋白在结构上发生的任何改变都有可能极大的影响PS的结构与功能，进而影响光合作用的效率。因此在时间框架下对psbA基因进行适应性进化分析将有助于进一步阐明光合作用中功能基因适应性进化的机制。生物进化就是生物与环境之间相互作用并导致遗传系统与表型发生一系列不可逆改变并不断适应环境的过程（杨继等. 植物生理学，高等教育出版社）。在分子水平上进行适应性进化分析可
8、以为蛋白的结构和功能研究提供重要的参考信息。尤其是1962年Zuckerkandl提出分子钟假说之后，人们可以在时间框架下研究生物的进化历史，并将生物的进化与地质史上的重大事件联系起来，有助于深入理解环境变迁影响生物适应性进化的机制。经过近五十年的发展与完善，如今的“分子钟”假说已经较好的解决了不同谱系间分子异速进化的问题，即使在缺少化石资料的情况下也可以很好的估计物种的分歧时间，这为研究早期物种的适应性进化提供了契机。鉴于psbA基因在光合作用中的重要作用以及GenBank中已经收录了大量的psbA基因全序列，本研究选取110种耳叶苔科植物的psbA基因全序列进行适应性进化分析，目的在于：（
9、1）通过估计耳叶苔科各物种的分化时间，推测可能影响其进化的地质事件；（2）检测psbA基因各位点在进化过程中承受的选择压力，进而推断在维持D1蛋白结构、功能以及适应环境方面发挥重要作用的位点，为D1蛋白的结构功能研究提供参考资料。1、材料和方法1.1序列数据从GenBank下载110种耳叶苔科植物以及6种作为外类群的细鳞苔科植物的psbA基因全长序列(表1)。应用Clustal X 2.0软件9对序列进行多重比对并加以手工校正；编辑后的序列矩阵中，每条序列包含有1059个核苷酸，353个密码子。本文中氨基酸位点编号参照Lejeunea pallescens（ABL86495）的编码。1.2 耳
10、叶苔科系统发育重建与分歧时间估计运行Modeltest 3.7软件选取最优的核苷酸进化模型。根据Modeltest选取的GTR+I+G模型设置似然模型参数，用Mrbayes 3.1.2软件经贝叶斯途径构建系统发育树。系统发育模型的后验概率依据Mropolis-Hastings-Green算法通过4条链（Markov Chain Monte Carlo, MCMC）运行15 000 000代估计。MCMC分析以随机树起始，每100代保存1棵树，使用Tracer v1.4.1软件12检验各参数的收敛程度。最初的37500棵树被当作老化样本摒弃，以剩余样本构建系统发育树。采用BEAST v1.5.3
11、软件10中的UCLD（Uncorrelated Lognormal Distributed Relaxed Clock Model）分子钟模型估算各分支的分歧时间，利用最近共同祖先时间（Tmrca，the most common ancient）对各分支的分歧时间加以校正。根据Modeltest 3.7软件11选取的核苷酸替换模型设定MCMC运算的参数，迭代运算30 000 000代，每1000代保存1株样本；利用Tracer v1.4.1软件12检验各参数的收敛程度。将最初的7500棵树作为老化样本摒弃，用剩余样本重建时间尺度下的一致树。表1 植物材料及其psbA基因GenBank登录号 T
12、able 1 Plant materials and their psbA gene GenBank accession numbers中文名Chinese name学名Species nameGenebank登录号Accession number-Frullanoides mexicana Slageren. EF011851-Frullania aculeata Taylor FJ380698喙尖耳叶苔Frullania acutiloba Mitt.FJ380572-Frullania aff. neurota Costa & Gradstein FJ380637-Frullania a
13、mplicrania Steph.FJ380599-Frullania ampullifera J.B. Jack & Steph.FJ380561-Frullania anderssonii Angstrom.FJ380558-Frullania angulata Mitt.FJ380703-Frullania anomala E.A. Hodgs. FJ380611-Frullania apicalis Mitt.FJ380695尖叶耳叶苔Frullania apiculata (Reinw., Blume & Nees) Dumort. FJ380681折扇耳叶苔Frullania ar
14、ecae (Spreng.) GottscheFJ380624-Frullania armitiana Steph.FJ380676-Frullania aterrima (Hook.f. & Taylor) Gottsche, Lindenb. & NeesFJ380680-Frullania atrata (Sw.) Dumort.FJ380687-Frullania azorica Sim-Sim et al.FJ380586缅甸耳叶苔Frullania berthoumieuii Steph.FJ380563细茎耳叶苔Frullania bolanderi Austin.FJ38067
15、1-Frullania brasiliensis RaddiFJ380700-Frullania brittoniae A. Evans.FJ380592-Frullania californica (Austin ex Underw.) A. EvansFJ380658-Frullania cf. madothecoides Davis AY607942-Frullania chevalieri (R.M. Schust.) R.M. Schust. FJ380616-Frullania congesta (Hook.f. & Taylor) Hook.f. & Taylor ex Gottsche et al.FJ380645-Frullania cuencensis TaylorFJ380636-Frullania deplanata Mitt.FJ380568-Frullania depressa Mitt.FJ380634-Frullania diptera (Lehm.) Gottsche, Lindenb. & Nees FJ380570-Frullania duthiana Steph.FJ380593-Frullania ebo
