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1、食品微生物检验学二、食品微生物检验学1、概念食品微生物检验学是运用微生物学的理论与技术，研究食品中微生物的种类、特性等，建立食品微生物学检验方法和确定食品卫生的微生物学标准的一门应用性科学。2、特点1)研究对象以及研究范围广:食品种类多，各有特色，分布不同；微生物的种类非常多，数量巨大；在食品来源、加工、运输等都可能受到各种微生物的污染。2)涉及学科多样 :涉及生物学、生物化学、工艺学、发酵学等方面的知识，以及兽医学方面的知识等。3)实用性及应用性强:在促进人类健康方面起着重要的作用。检验利用、控制微生物防止食品变质和杜绝因食源性病害保证食品卫生的安全。4)采用标准化(受法规约束):中华人民共
2、和国国家标准食品卫生检验方法是法定的检验依据。3、目的 为生产出安全、卫生、符合标准的食品提供科学依据，保证人类获得符合卫生要求、适于人类消费的食品。4、食品微生物检验学的任务1)研究各类食品中微生物种类、分布及其特性2)研究食品的微生物污染及其控制，提高食品的卫生质量3)研究微生物与食品保藏的关系4)研究食品中的致病性、中毒性、致腐性微生物5)研究各类食品中微生物的检验方法及标准5、食品微生物检验的发展食品微生物检验学的发展是与整个微生物学的发展是分不开的。人类很早就开始利用微生物的许多特性为人类的生产、生活服务，古代人类早已将微生物学知识用于工农业生产和疾病防治中，公元前二千多年的夏禹时代
3、，就有仪狄酿酒的记载。北魏(公元386534年)齐民要术一书中详细记载了制醋的方法。长期以来民间常用的盐腌、糖渍、烟熏、风干等保存食物的方法，实际上正是通过抑制微生物的生长而防止食物的腐烂变质。在预防医学方面，我国自古就有将水煮沸后饮用的习惯。明朝李时珍在本草纲目中指出，将病人的衣服蒸过后再穿就不会传染上疾病，说明已有消毒的记载。1)致病菌检测阶段微生物的发现：首先观察到微生物的是荷兰人吕文虎克(Antory Van Leeuwenhoek，16321723)。他于1676年用自磨镜片制造了世界上第一架显微镜(约放大300倍)，并从雨水、牙垢等标本中第一次观察和描述了各种形态的微生物，为微生物
4、的存在提供了有力证据，并确定了细菌的三种基本形状：球菌、杆菌和螺旋菌，吕文虎克也被称为显微镜之父。微生物与食品腐败：法国科学家巴斯德(Louis Pasteur,18221895)首先实验证明有机物质的发酵与腐败是由微生物作用的结果，而酒类变质是因污染了杂菌，从而推翻了当时盛行的自然发生说。巴斯德病原体研究和预防方面也作出了卓越的贡献，他发明了巴氏消毒法，被称为现代微生物学之父。病原微生物：19世纪末至20世纪初，在巴斯德和科赫光辉业绩的影响下，国际上形成了寻找病原微生物的热潮。有关食品微生物学方面的研究也主要是检测致病菌。我国从50年代起开始对沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌等食物中毒菌进行调查研
5、究，并建立了各种食物中毒的细菌分离鉴定方法。2)指示菌检测阶段在我国，80的传染病是肠道传染病，为了预防肠道传染病，各种食品微生物的检验方法和检验标准的制定，是食品微生物检验的重要研究内容之一。通过这些方法和标准，可以检测并判断水、空气、土壤、食品、日常用品以及各类公共场所的安全卫生状况。但是，直接检测目的病原微生物，难(why?)需寻找带有指示性的微生物(指示菌) 根据其检出情况，判断样品被污染程度，并间接指示致病微生物有无存在可能，以及对人群是否构成潜在威胁。指示菌(Indicator Organism)：是在常规安全卫生检测中，用以指示检验样品卫生状况及安全性的指示性微生物。检验指示菌的
6、目的，主要是以指示菌在检品中存在与否以及数量多少为依据，对照国家卫生标准，对检品的饮用、食用或使用的安全性作出评价。这些微生物应该在环境中存在数量较多，易于检出，检测方法较简单，而且具有一定的代表性。指示菌可分为三种类型：A 评价被检样品一般卫生质量、污染程度以及安全性的指示菌最常用的是菌落总数、霉菌和酵母菌数。B 粪便污染的指示菌主要指大肠菌群。其他还有肠球菌、亚硫酸盐还原梭菌等。其检出标志着检品受过人、畜粪便的污染，而且有肠道病原微生物存在的可能性。C 其他指示菌包括某些特定环境不能检出的菌类，如特定菌、某些致病菌或其他指示性微生物。3)微生态制剂检测阶段19世纪人们就发现并开始认识厌氧菌
7、(巴斯德，1863)，但直到20世纪70年代了解到厌氧菌主要是无芽孢专性厌氧菌后，才开始重新重视其研究。厌氧菌广泛分布在自然界，尤其是广泛存在于人和动物皮肤和肠道。生态平衡时，与人和动物体“和平共处”。生态失调时，成为条件致病菌(opportunistic organism)，形成厌氧菌感染症。由此，市场上出现了以乳酸菌、双歧杆菌为主的各种微生态制剂后(1980s以来)，检验其菌株特性和数量就成了目前食品微生物检测的一项重要内容。4)现代基因工程菌和尚未能培养菌的检测转基因动物、植物和基因工程菌被批准使用以及进入商品化生产，加大了食品微生物检测的任务。目前也发现了一些尚未能培养的微生物，这也促
8、进了食品微生物检验技术的发展。在微生物应用技术、实验方法方面也有极其迅速的发展。如电镜技术的进步，并结合生物化学、电泳法、免疫化学等的技术，推动了对微生物的分类和鉴定。荧光抗体技术、单抗技术、PCR技术等，也进一步促进了微生物检验的发展。6、我国食品微生物检验机构1)进出口检验 国家质量监督检验检疫总局2)国内检验 中国疾病预防控制中心(CDC)营养与食品安全所是我国食品卫生检验评价的权威机构。 食品卫生监督机构：各级卫生局下属 卫生监督所 屠宰检验：兽医卫生监督所+单位自检 食品加工企业自检食品微生物检验学作为给人类提供有益于健康、能确保食用安全的食品的科学保障之一，业已受到人们的重视，有着
9、广阔的发展前景。第一章 微生物检验鉴定技术第一节 微生物检验基本知识包括显微镜检、染色技术、培养基制备技术、接种、分离纯化和培养技术等一、接种(inoculation)将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。1. 接种工具 接种针 接种环 接种钩 玻璃涂棒 接种圈 接种锄 小解剖刀2. 常用的接种方法 有以下几种：1)划线接种 最常用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。2)三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。3)穿刺接种 在保
10、藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常用。用的接种工具是接种针。培养基一般是半固体培养基4)倾注接种 该法是将待接种微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，以达到稀释菌液的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。5)涂布接种 先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，使菌液均匀分布，即可长出单个菌落。6)液体接种 从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中；或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，都属于液体接种。7)注射接种 用注射的方法将微生物转接至活的生物体内，常见的疫苗预防接种，就
11、是用注射接种。8)活体接种 是专用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式有注射、灌喂、拌料喂养等。3. 无菌操作(Aseptic technique)培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具(如接种针和吸管等)在无菌条件下接种含菌材料(如样品、菌苔或菌悬液等)于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。 在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。二、分离纯化(Isolation)含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物(Mixed culture)。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培
12、养(Pure culture)。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。1、倾注平板法( Pour plate ) 2、涂布平板法(Spread plate)3、平板划线法(Streak plate)常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。4、富集培养法富集培养法的方法和原理非常简单。我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其它微生物。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。
13、通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。5、厌氧法在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把它放在沸水浴中加热数分钟，以便逐出溶解氧。然后快速冷却，并进行接种。接种后，加入无菌石蜡于培养基表面，使与空气隔绝。另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。三、培养1、根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养和厌氧培养。好氧培养(Aerobic Incubation) ：也称“好气培养”。 厌氧培养(Anaerobic In
14、cubation)：也称“厌气培养”。2、根据培养基的物理状态，可分为固体培养和液体培养两大类：固体培养：solid incubation 液体培养：liquid incubation第二节 微生物常规鉴定技术一、形态结构和培养特性观察1、微生物的形态结构观察微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构(包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。2、微生物培养特性观察革兰染色法，丹麦病理学家C.Gram 1884年创立(1)涂片 (2)晾干 (3)
15、固定 (4)结晶紫色染色：1min。水洗 (5)媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。水洗(6) 脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色2025s至流出液无色，立即水洗。(7) 复染：滴加蕃红复染5min。水洗(8) 晾干：晾干或者用吸水纸吸干。(9) 镜检：先用低倍，再用高倍，最后用油镜。(10)实验完毕后的处理：浸过油的镜头：a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦23次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦23次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。细菌染色玻片用废擦镜纸将香柏油擦干。微生物培养特性的观察是微生物检验鉴别中的一项重要内容。1)细菌的培养特征 包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色(色素是水溶性还是脂溶性)、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况(菌膜、环)混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。2)霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉
