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1、香蕉易感枯萎病和水杨酸诱导抗枯萎病的分子机理研究香蕉和大蕉是热带、亚热带重要的农作物之一，联合国粮农组织(FAO)已将香蕉列为继水稻、小麦和玉米之后的第四大粮食作物。但香蕉在生产中常常受到病虫、台风、低温、干旱等胁迫的影响, 特别是近年来土传病害香蕉枯萎病已给香蕉生产带来毁灭性的灾难。到目前为止对香蕉枯萎病尤其是4 号生理小种(Foc TR4) 引起的香蕉枯萎病还没有有效的方法进行治疗, 只能通过一些非特效的方法进行预防和控制, 显然这是不能满足香蕉产业发展的需求。要想防治香蕉枯萎病, 必须深入研究香蕉枯萎病发病的机理, 这样才能有的放矢地进行治疗和防控。本研究以易感Foc TR4 的香蕉品种
2、(Musa acuminata L. AAA group, cv.Brazilian) 为材料 , 研究香蕉的感病机理。本研究主要研究了枯萎病菌侵染香蕉的病程、侵染方式和侵染过程中香蕉根系生理生化方面的变化；通过利用RNA-seq和数字基因表达谱技术获得香蕉接种 Foc TR4后在2天、4天和6天根系基因的差异表达情况, 全面分析香蕉易感枯萎病的原因；根据分析的结果我们进一步证明水杨酸在香蕉诱导抗病性方面的作用机制。主要结果如下：(1)利用GFPfe记的Foc TR4观察病原菌侵染香蕉根系的过程。 结果发现在接种2 天后病源菌以菌丝体、大型分生孢子和小型分生孢子的形式附着于根系表皮细胞；在接种
3、4 天后病原菌经表皮侵染根系内部, 优先沿细胞间层生长：接种 6 天后 , 观察到病原菌以菌丝体的形式在根系中大量繁殖, 并深入根系内部；同时在根系未被侵染的地方细胞已经出现细胞褐化和死亡现象。与此同时活性氧清除相关的酶如 CAT APX SOD PODffi与病相关的生理指标如PAL MD母口 H202等，其酶活性或含量在接菌2-4天后形成明显的峰值,这些结果表面在接种6 天后香蕉已经对病原菌的侵染做出生理上的响应。(2) 香蕉根系转绿组的获得与分析。. 通过提取0 天 (0 day post inoculation,0 DAI) 、接种后2 天 (2 DAI) 、接种后4天(4 DADff
4、i接种后6天(6 DAI)香蕉根系的总RNA等量混合后构建文库进 行测序 , 获得 26,662,006 条原始读段, 核苷酸数为2,399,580,540 bp, 读段平均长度为90 bp。经过滤除去低质量测序片段和组装后小于500 bp的序列，共获得25,158 条 Unigene, 其中 5,166 条大于 2000 bp, 平均长度为1,439 bp 。将这些Unigene进行GOib类注释,能够注释到GO：据库中的Unigene有 17,540条。利用BLASTAL进彳T KEG献谢途径注释出11,611条Unigene,这些 Unigene分布在192个KEG献谢途径中。这些结果说
5、明本研究获得一套高质量香蕉根系转绿组, 该转录组获得的基因条数远远大于NCBI上所有香蕉的EST数量，为进一步研究根系响应Foc TR4侵染 基因的差异表达提供了保证, 同时也为进一步研究感病相关的关键基因提供了方便。(3)香蕉根系接种Foc TR4后根系基因差异表达情况的分析。分别对接种Foc TR40 DAI、2 DAI、4 DAI和6 DAI的香蕉根系进行DGEM 序，分别构建上述4个时间点的DGEt库，每一个文库大约产生了 14,381,000个 初始标签。去除低质量标签后，4个DGE中的干净标签均在3,254,559至U 3,561,806 之间 , 占总标签的数的92.43%-93
6、.97%,这表示每个样品都含有超过320 万个清晰标签, 进一步将这些标签与参考转录组相匹配。将接种后的样本与未接种的样本(O DAI) 比较 , 筛选差异表达基因。设定FDR<0.001和10g2Ratio1作为阂值来判断基因在两个时期差异表达。在2 DAI中有4,729个基因相对于0 DAI发生差异表达。在4 DAI中有5,078个基因相对于0 DAI 发生差异表达。在 6 DAI 中有 5,531 个基因相对于0 DAI 发生差异表达。将上述基因进行GCfe著性富集分析，富集的条件是FDRK正P值 0.05 o有趣的是3个时间点中所有的下调表达基因的 GO功能显著分析均未富集到任彳
7、5r GO条目。在2 DAI的上调表达基因里富集出8个GO条目。在4DAI中富集22个GO条目。在6 DAI中富集出的G次目数目大幅减少, 仅富集出11个GO条目。将所有差异表达基因映射到 KEG健径中。在KEG砥也未发现下调表达基因富集出途径。2 DAI 中富集出5个代谢途径。4 DAI 中富集出3 个代谢途径。6 DAI 中富集出5个代谢途径。综合以上结果表明, 在感病的香蕉品种中还留存多条抗病途径，如GS修与的解毒功能、茉莉酸介导的诱导系统抗性(Induced systemic resistance, ISR) 抗病途径以及 PO辱与的细胞壁加厚等，这些结果与之前报道结果相吻合, 但这些
8、抗性因子或途径均不能有效阻止FocTR4的入侵，而经分析后发现NBS-LRRg因家族、免疫相关基因的下调表达和未激活水杨酸的生物合成和信号传导途径相关基因的表达可能是香蕉感病的原因。(4) 进一步鉴定水杨酸参与香蕉抗枯萎病的过程和外源水杨酸诱导香蕉抗枯萎病的分子机制。在香蕉根系全转录组条件下, 搜索莽草酸途径和苯丙素合成途径相关基因，去除包含N的序列，保留最长序列，经RT-PCFT增并测序后在NCBI 上BLASTS对，共获得31条序列。莽草酸途径相关基因在耐病品种中大部分被上调表达, 其表达量增加倍数要 大于其在感病品种中的表达量增加倍数，但在分支酸生物合成关键酶 CS的表达却并不明显, 表
9、明两个不同抗病性的基因在分支酸处并未发生明显的差异。苯丙素合成途径基因在感病品种全部时间点极显著下调表达, 而少数极显著上调一般发生在 2 DAI, 但在整个过程其表达变化倍数远远小于在耐病品种, 所以在耐病品种中苯丙素合成基因表达被全面激活, 而感病品种中则被抑制。在转录组中寻找水杨酸信号途径相关基因, 共获得 14 条序列。 水杨酸信号途径基因在感病品种中的表达未被激活, 而在耐病品种中该途径的基因均被激活,所以激活水杨酸信号途径能赋予香蕉一定的抗病性。内源水杨酸在耐病品种接种Foc TR4 2 DAI 时 , 水杨酸出现了累积现象, 而感病品种则出现内源水杨酸含量减少现象, 说明水杨酸的
10、含量与香蕉的抗病性正相关。以100仙M浓度的SA预处理生长60天的香蕉幼苗2天，之后接种Foc TR4, 浓度为1.5 X 106个/mL,而在SA于处理后接菌3周后香蕉幼苗则没有任何外部病 症出现 , 植株大小与对照没有明显的变化, 而在未处理的材料中出现了明显的感病症状。在内部症状方面，Foc TR4处理的香蕉幼苗球茎已经褐变，而水杨酸处理的香 蕉幼苗球茎并未发现明显的褐变。因此SA处理能提高香蕉对Foc TR4的抗病性。外源水杨酸能提高接菌后内源水杨酸的含量。外源水杨酸全面激活莽草酸途径和苯丙素生物合成途径基因和水杨酸信号传导相关基因。因此综合上述结果证明外源水杨酸能使香蕉获得对枯萎病很好的抗病性, 而这种抗病性是由于外源水杨酸促进内源水杨酸含量的增加, 通过激活水杨酸生物合成途径和信号传导相关基因的表达实现的。综上所述, 本研究以生理学为基础,从转绿组学入手分析香蕉易感枯萎病的分子机制, 并对分析结果进一步验证, 阐述了香蕉感病的原因是水杨酸的生物合成和信号传导途径被抑制, 外源水杨酸通过激活水杨酸代谢途径能增强香蕉对枯萎病的抗性。这些结果不仅丰富了香蕉与枯萎病菌互作的分子机理, 也为防治香蕉枯萎病提供了新的方法。
