《论文-邵帅-正交试验法优选小蓬草总生物碱提取工艺》由会员分享，可在线阅读，更多相关《论文-邵帅-正交试验法优选小蓬草总生物碱提取工艺（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、正交试验法优选小蓬草总生物碱提取工艺邵帅，严铭铭*，吴程彦，刘畅，付美丽，田双，王天宁（长春中医药大学，吉林 长春 130117）摘要 目的：优选小蓬草中总生物碱的提取方法与工艺。方法：采用单因素和正交试验法，考察提取次数、提取时间、提取溶剂浓度及料液比对总生物碱提取率的影响。结果：最终确定提取工艺为90%乙醇回流提取3次，每次1h ，料液比为12：1。结论：该方法分离总生物碱是一种经济简便、效率较高的方法。关键词 小蓬草；生物碱；正交试验；提取工艺Optimization of Extraction Technology of Total Alkaloids of Conyza canade
2、nsis L. Cronq. By Orthogonal TestShao Shuai, Yang Ming-ming*, Wan Zhi-qiang, Liu chang, (Changchun University of Traditional Chinese Medicine, Changchun Jilin 130117 ,China)Abstract Objective: To optimize extraction technology of total alkaloids in Conyza canadensis L. Cronq. Method: Using single fa
3、ctor and orthogonal test to investigate the effect of the extraction times and time, the concentration of the solution and solid-liquid ratio on extraction amount of total alkaoids. Results：The best extraction conditions as follows: 90% ethanol backward flowing three times for 1h, liquid ratio is 12
4、:1. Conclusion: The methods of extraction of alkaloids with alcohol are economy、convenient and highly efficient.Key Word Conyza canadensis L. Cronq.; alkaoids; orthogonal test; extraction technology小蓬草为菊科植物小白酒草Conyza canadensis L. Cronq. 1的干燥全草，又名加拿大蓬、小白酒草、小飞蓬、祁州一枝蒿。广泛分布于中国各地。全草入药具有清热利尿、散瘀消肿之功效，用于治疗
5、肠炎、痢疾、传染性肝炎、胆囊炎、中耳炎等症2。近年来本课题组对该药材进行了深入研究，已分离出黄酮、生物碱、三萜、有机酸及挥发油等四十余种化合物3-5。本研究拟在前期工作的基础收稿日期：基金项目：国家重大新药创制专项（2009ZX09103-323）作者：邵帅（1979），女，副教授，博士研究生，主要从事：药物化学、中药化学及新药研究开发工作。Tel:13689822307 E-mail:。通讯作者：严铭铭（1968），女，教授。上，用乙醇从小蓬草中提取总生物碱，并以甜菜碱为对照品，用雷氏盐比色法8测定其含量，同时采用正交试验法对提取条件进行优化。1 实验材料与仪器1.1 仪器UV-1700型分
6、光光度计（日本岛津公司）；METTLER-AE240型电子分析天平（瑞士METTLER公司）；BUCHI旋转蒸发仪（瑞士 BUCHI 公司）1.2 材料与试剂小蓬草采于吉林省长白县，经长春中医药大学姜大成教授鉴定为菊科小白酒草属植物小白酒草Conyza canadensis L. Cronq.的干燥全草。甜菜碱对照品（购于中国药品生物制品检定所，批号110894-200503）；利英纳克盐（国药集团化学试剂有限公司）；试剂均为分析纯。2 实验方法与结果2.1 小蓬草总生物碱的含量测定采用雷氏盐比色法。原理是利用小蓬草总生物碱在酸性条件下转化成生物碱阳离子B+，该离子与雷氏盐反应，生成不溶于水的
7、生物碱雷氏铵盐沉淀，分离沉淀，以丙酮溶解，此生物碱雷氏铵盐丙酮溶液在521nm处有最大吸收，通过紫外分光光度计测定吸光度（A），计算雷氏铵盐含量，并换算成总生物碱含量。2.1.1 对照品溶液制备精密称取甜菜碱对照品133.1mg，置于100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度,摇匀即得。2.1.2 供试品溶液制备精密称取小蓬草粗粉10g，加入乙醇100ml，加热回流提取2次，每次1h，合并提取液，过滤，滤液蒸干，即得小蓬草总生物碱提取物。取上述提取物2g，置于100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度,摇匀即得。2.1.3 检测波长的确定精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2ml，置于100m
8、l烧杯中，加水至30ml，用2mol/L 盐酸调pH至l，冷至5，加入20ml雷氏盐，于5陈化34h，抽滤，沉淀用乙醚洗涤，滤过，所得沉淀用丙酮溶解并转移至25ml容量瓶中，定容，摇匀。同法制得空白溶液，在300700nm进行全波长扫描。结果显示二者均在523nm处有最大吸收，故确定检测波长为523nm。2.1.4 标准曲线绘制分别精密吸取6.00，8.00，10.00，12.00，14.00，16.00ml对照品溶液置于100ml烧杯中，按2.1.3项下方法显色，在523nm处测定吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线：A=1.328C-0.3135(r=0.999
9、7)。表明甜菜碱在0.31940.8518mg/ml范围内与吸光度呈良好的线形关系。2.1.5 精密度试验精密吸取对照品溶液10ml置100ml容量瓶中，按2.1.3项下方法显色，平行测定6次，计算A的RSD为0.56，表明仪器精密度良好。2.1.6 稳定性试验取对照品溶液和供试品溶液，分别于制备后15、30、45、60、120min测定A，结果RSD0.91，RSD1.02表明待测溶液在2h内稳定。2.1.7 重现性试验取同一批号样品6份，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，进行含量测定，结果RSD0.79，表明该方法重现性良好。2.1.8 加样回收率试验精密称取5份已知含量的小蓬草总生物碱
10、粗干膏约100mg置100ml烧杯中，再分别加入甜菜碱对照品1mg和50ml蒸馏水，超声使其溶解，过滤，滤液转移至100ml的容量瓶中，蒸馏水定容至刻度。按2.1.3项下方法显色，结果平均回收率99.43%，RSD0.90%。2.1.9 供试品溶液测定精密吸取小蓬草供试品溶液10ml，其余步骤同2.1.3，在523nm下测定其吸光度，带入标准曲线计算其总生物碱含量。2.2 提取工艺优选通过预试验考察，选取提取次数、提取时间、溶剂浓度和溶剂用量为考察因素，以总生物碱含量为考察指标，采用L9(34)正交表进行试验，确定最佳提取工艺。因素水平见表1，正交试验结果见表2，方差分析见表3。表1 小蓬草总
11、生物碱提取工艺正交试验因素水平水平提取次数（A）提取时间（B）醇浓度（C）加醇量（D）11185%乙醇8221.590%乙醇1033295%乙醇12表2 小蓬草总生物碱提取工艺正交试验结果（n=2）ABCD实验序号提取次数提取时间醇浓度加醇量总生物碱含量(%)*11 1 1 1 3.05 21 2 2 2 3.69 31 3 3 3 3.89 42 1 2 3 5.51 52 2 3 1 4.96 62 3 1 2 4.86 73 1 3 2 5.53 83 2 1 3 5.78 93 3 2 1 5.68 I10.630014.090013.690013.6900II15.330014.43
12、0014.880014.0800III16.990014.430014.380015.1800I/33.54334.69674.56334.5633II/35.11004.81004.96004.6933III/35.66334.81004.79335.0600R2.12000.11330.39670.4967表3 小蓬草总生物碱提取工艺正交实验方差分析方差来源离均差平方和自由度方差F显著性Pa7.2550 23.6275 282.4187 *0.05b0.0257 20.0128 1.0000 c0.2380 20.1190 9.2656 *0.5d0.3980 20.1990 15.493
13、9 *DCB。方差分析表明，因素A有极显著性差异，因素C、D有显著性差异，因素B对实验结果无明显影响，所以最终确定以总生物碱含量为指标进行测定时，小蓬草总生物碱的最佳提取工艺为A3B1C2D3，即：90%乙醇提取3次，每次1h，溶剂用量为12倍量。2.3 验证实验称取小蓬草3份，每份100g，按优选的工艺条件进行3次验证试验。结果表明总生物碱平均含量6.02%，RSD1.10%。说明此工艺条件稳定、可行。3 讨论在对小蓬草进行化学成分研究时，已分离出甜菜碱、盐酸小檗碱、硫酸阿托品等生物碱类成分6，且甜菜碱含量较高，故选择甜菜碱作为对照品测定其总生物碱含量。本实验采用雷氏盐比色法进行含量测定，之
14、前进行了验证试验。取雷氏沉淀少许，丙酮溶解后，薄层板展开，展开剂为丙酮：无水乙醇：浓盐酸=5：3：0.6，生物碱斑点几乎全部被沉淀下来，达到了预期的效果，同时证实了小蓬草总生物碱的含量测定方法选择雷氏盐沉淀法是可行的。另外，雷氏盐要现用现配，因为在室温下可分解。且雷氏盐的丙酮或丙酮-水溶液的吸收值，随时间而变化，故应尽快的测定。参考文献1 中国科学院中国植物志编辑委员会编著.中国植物志.科学出版社，1985:348.2 林镕.中国植物志.第74卷.M.北京：科学出版社，1985：135.3 严铭铭，邵帅，叶豆丹，等.小飞蓬化学成分的研究J.中草药，2012,43（10）：1920.4 邵帅，严铭铭，毕胜男，等.小飞蓬挥发性化学成分的GC-MS分析J.中国实验方剂学杂志，2012,18（8）：116.5 邵帅，严铭铭，毕胜男，等.小飞蓬药材薄层鉴别与含量测定J. 中国实验方剂学杂志，2012,18（24）：101.6 王曙滨，宋宏刚.雷氏盐比色法测定川芎季铵型总生物碱的含量J.中南药学，2009，7（11）：824-826.
