《硕士毕业论文——数字PCR在转基因生物及其产品检测中的应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《硕士毕业论文——数字PCR在转基因生物及其产品检测中的应用（93页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、上海交通大学硕士学位论文 摘要上海交通大学硕士学位论文数字PCR在转基因生物及其产品检测中的应用专 业： 生物学硕 士 生： 导 师： 上海交通大学生命科学技术学院 年 月摘 要转基因生物及其产品的标识管理是转基因生物安全管理的重要内容，不同的国家和地区都规定了不同的转基因产品标识阈值，这就对转基因产品的定量检测技术提出了较高的要求。目前，荧光定量PCR技术在转基因产品的定量检测中广泛应用，但是该方法需要依赖标准曲线和标准物质，是一种相对定量技术，并且定量极限较低，不适用于转基因成分含量低的样品。近年来兴起的数字PCR能够通过极度稀释、泊松分布和终点法PCR实现绝对定量，并且具有较高的检测极限
2、和定量极限，在转基因生物及其产品的检测中具有巨大的应用潜力。本文围绕两种数字PCR，分析了其在转基因生物及其产品检测中的应用。1. 数字PCR可用于转基因生物标准物质的定值：（1）微滴式数字PCR（ddPCR）在基体标准物质的定值中，能够排除影响反应效率的抑制因子，定值的偏差比荧光定量PCR（qPCR）小；（2）ddPCR的动态范围可以达到100000拷贝，高于微流体芯片数字PCR（cdPCR）；（3）微滴式数字PCR由于分液数多，在定值的重复性上由于cdPCR；（4）ddPCR具有非常低的检测极限(0.25拷贝/反应)，能够用于单拷贝分子的检测，而两种数字PCR都比qPCR具有更低的定量极限
3、；（5）酶切后的质粒标准物质更加适合在数字PCR平台上进行定值。2. 数字PCR可用于转基因产品的精确定量分析：（1）ddPCR和cdPCR能够不依赖于标准曲线对转基因产品进行精确的绝对定量，同时还可以判断转基因生物的基因型；（2）ddPCR比qPCR更加适合用于双重定量分析，单重和双重的结果更为接近。3. 数字PCR可用于转基因生物外源基因的拷贝数分析。对于不同的基因，数字PCR和定量PCR测定的结果有所差异，并且基因组的酶切对数字PCR也产生了一定影响。这说明数字PCR和qPCR的反应原理、统计原理有所不同，可以作为转基因生物外源基因拷贝数的分析的新方法。 关键词: 转基因生物，检测，定量
4、，荧光定量PCR，数字PCRIV上海交通大学硕士学位论文 AbstractTHE APPLICATIONS OF DIGITAL PCR IN DETECTION FOR GMOS AND THEIR DERIVED PRODUCTSAbstractLabeling management is an important part of regulation on genetically modified organisms (GMOs). Thresholds are set by different countries, which need excellent quantification
5、 technologies. Currently, real-time quantitative PCR (qPCR) is widely used in quantification of GMOs. However, this method relies on the standard curve and reference material, which lead it to a relative quantification method. Moreover, the limit of quantification of real-time PCR is high. Samples w
6、ith low GMO content cannot quantified by qPCR. Digital PCR (dPCR) can realize absolute quantification through limit dilution, Poisson distribution and endpoint PCR. It shows potential in GMOs detection. In this research, two kind of digital PCR platforms were applied in GMO detection.1. Digital PCR
7、can apply in determing the certified value of GMO reference material. (1)Droplet digital PCR (ddPCR) can exclude matrix effect of qPCR and obtain the certified value with a smaller bias than qPCR. (2) ddPCR had a higher dynamic range (within 100,000 copies) than chamber digital PCR (cdPCR). (3) ddPC
8、R presented a good repeatability on certified value than cdPCR, attribute to the more partitions. (4) ddPCR had a low limit of detection (0.25 copies/reaction). Both ddPCR and cdPCR had a lower limit of quantification than qPCR. (5) Digtal PCR can work better on degisted plasmid reference material.2
9、. Digital PCR can apply in accurate quantification of GMO products. (1) Both ddPCR and cdPCR can realize absolute quatification of GMOs products wihout standard curve and reference materials. Moreover, digital PCR can decide the genotype of GMOs. (2) ddPCR performed better than qPCR in duplex quanti
10、fication. The results of simplex and duplex on ddPCR were closer than qPCR.3. Digital PCR can apply in estimating copy number of transgenes in GMOs. Digital PCR and qPCR tested different copy number on some genes. The degistion of genome had an effect on digtal PCR instead of qPCR. Thus, digital PCR
11、 was different form qPCR on principle and data statistics. Digital PCR can act as a new method in estimating copy number of transgenes in GMOs.Keywords: GMOs, detection, quantificaiton, real-time PCR，digital PCR上海交通大学硕士学位论文 第一章目 录摘 要IABSTRACTIII目 录5第一章 转基因生物及其定量方法研究进展71.1转基因生物发展现状81.1.1全球转基因生物发展现状81
12、.1.2中国转基因生物发展现状91.2转基因生物及其产品的标识管理101.2.1强制性标识101.2.2自愿性标识111.2.3低水平混杂的管理121.3转基因生物及其产品定量检测方法概述121.3.1转基因成分含量表述方式121.3.2荧光定量PCR131.3.3数字PCR151.3.4数字PCR及其应用201.3.5展望21第二章 数字PCR在转基因生物标准物质定值中的应用22第一节 通过数字PCR对转基因生物基体标准物质定值232.1实验材料、试剂与仪器232.1.1实验材料232.1.2实验仪器232.1.3实验试剂242.2实验方法242.2.1三种方法提取植物基因组DNA242.2
13、.2 DNA质量评价方法252.2.3引物和探针的设计272.2.4荧光定量PCR的反应体系和条件272.2.5ddPCR反应体系和条件282.2.6cdPCR反应体系和条件292.3实验结果与讨论292.3.1三种抽提方法所得DNA质量评价292.3.2荧光定量PCR定值结果312.3.3 ddPCR定值结果332.3.4cdPCR定值结果342.3.5三种平台定值结果的分析比较352.3.6数字PCR平台性能的分析362.4小结42第二节 通过数字PCR对转基因生物质粒标准物质定值432.1实验材料、试剂与仪器432.1.1实验材料432.1.2实验仪器432.1.3实验试剂432.2实验
14、方法432.2.1提取质粒分子DNA432.2.2 DNA质量评价方法442.2.3质粒分子的酶切及回收442.2.4引物和探针的设计442.2.5荧光定量PCR的反应体系和条件452.2.6ddPCR反应体系和条件452.2.7cdPCR反应体系和条件452.3实验结果与讨论452.3.1酶切结果及DNA质量评价452.3.2荧光定量PCR定值结果462.3.3ddPCR定值结果462.3.4cdPCR定值结果472.3.5三种平台定值结果的分析比较482.4小结49第三章 数字PCR在转基因产品精确定量中的应用50第一节 数字PCR可用于转基因生物基因型的分析513.1实验材料、试剂与仪器513.1.1实验材料513.1.2实验仪器513.1.3实验试剂513.2实验方法513.2.1提取植物基因组DNA513.2.2 DNA质量评价方法513.2.3引物和探针的设计523.2.4荧光定量PCR的反应体系和条件523.2.5ddPCR反应体系和条件523.2.6cdPCR反应体系和条件523.3实验结果与讨论523.3.1DNA质量评价523.3.2荧光定量PCR定量结果533.3.3ddPCR定量结果533.3.4cdPCR定量结果543.3.5三种平台定量结果的分析比较553.4小结5
