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1、实验一 植物体内过氧化物酶活性的测定一、目的过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控IAA水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的H2O2的毒害作用。故在科研上常加以测定。二、原理在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色4邻甲氧基苯酚，在470nm波长处测定生成物的吸光度（A）值，即可求出该酶活性。三、材料、仪器设备及试剂 1. 材料：植物叶片 2. 仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。 3. 试剂及配制：0.1molL1磷酸缓冲液（pH7）。反应液（100ml 0.
2、1molL1磷酸缓冲液（pH6）中加入0.5ml 愈创木酚、1ml 30H2O2，充分摇匀）。四、实验步骤1. 酶液提取称取植物叶片1g，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为10ml pH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在8000 r / min离心15min，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。 2. 酶活性测定吸取反应液3ml 于试管中，加入酶提取液0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径1cm的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在470nm波长处，以时间扫描方式，测定3min内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度
3、变化值（A470）。五、酶活性计算按下式计算酶的相对活性 A470 酶提取液总量（ml）酶活性（A470g1Fwmin1）= - 样品鲜重（g） 测定时酶液用量（ml）实验二 尿液淀粉酶活力测定(Winslow氏法) 原理】 临床上通常用Winslow氏法测定尿或血清中淀粉酶活力.该法对淀粉酶活性单位的规定是:在37,30分钟,恰好能将0,1%淀粉溶液1ml水解(指加入碘液后不再呈蓝色或红色)的酶量定为一个活力单位. 试剂和器材】 1,0.9%氯化钠 2,0.1%淀粉 3,碘化钾-碘溶液(20克碘化钾和10克碘溶于100毫升水中,使用前稀释10倍) 4,移液管 5,试管 6,恒温水浴锅 操作】
4、 1,取10支试管,按次序记上号码,各加0,9%氯化钠1毫升. 2,用1毫升移液管加尿液1毫升于第一管,使其与0.9%氯化钠混合 (若尿液中淀粉酶过多,应预先将尿液适当稀释).用移液管吸取,然后任其流出.反复三次,使全管混匀. 从第一管吸出1毫升到第二管中,混匀.吸出1毫升到第三管.依次类推.到第九管吸出1毫升弃之.这样即可获得分别含有尿液1/2,1/4,1/8.1/5 12毫升的不同浓度的尿稀释液,第10管不加尿液作为对照管. 3,将10支试管置冰水浴中,然后从第10管起依次迅速准确加入0.1%淀粉液1毫升.迅速摇匀.立即从冰水中取出,置37,并记录时间.注意保持水浴的温度. 4,保温30分
5、钟后,取出各管,迅速浸入冰水浴中冷却.然后向各管中加稀碘液2滴摇匀.观察各管的颜色.各试管中出现黄到兰的色序.黄色表明无淀粉存在,浅红色到紫色表明有淀粉的水解中间产物.兰色表明有淀粉或其初期水解产物存在. 计算】 选择黄色管中尿液稀释倍数最大的一管来计算.假设第5管为黄色(从第6管起仍有红色或兰色).已知第5管内含尿液为1/32毫升.即1/32毫升尿液能在37,30分钟水解0.1%淀粉1毫升.所以,1毫升尿液在同样条件下可水解0.1%淀粉32毫升,即每毫升尿液中所含淀粉酶的活性为32个活力单位. 实验三 超氧物歧化酶活性的测定 超氧物歧化酶活性的测定采用硝基四唑蓝还原法测定21。(一)原理超氧
6、物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。(二)材料、仪器设备及试剂1. 材料：新鲜苎麻叶片2. 仪器设备：(1) 研钵(预冷)； (2) TGL-16LG台式高速冰冻高速离心机(12 000r/min, 湖南
7、星科科学仪器有限公司)；(3) PUS-2018型 半自动生化分析仪(北京普朗新技术有限公司)；(4) 移液管（10ml,5ml,0.5ml,0.2ml各数支）；(5) 日光灯（反应试管处照度为4 000Lx）；(6) 试管数支；(7) 洗耳球。3. 试剂：(1) 0.2mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）: A.称取磷酸氢二钠7.8005g,溶解后转移到250ml容量瓶中，定容。B.称取磷酸二氢钠7.098g,溶解后转移到100ml容量瓶中，定容。C.将磷酸氢二钠溶液倒入烧杯中，用量筒量取23ml后加入同一烧杯中，用pH试纸调节其pH值至7.8；(2) 130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶
8、液：称1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml；(3) 750mol/L 氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；(4) 100mol/L EDTANa2溶液：称取0.03721g EDTANa2用磷酸缓冲液定容至1 000ml；(5) 20mol/L 核黄素溶液：称取0.00753g核黄素用蒸馏水定容至1 000ml避光保存。(三)实验步骤 1. 酶液提取取取被不同浓度NaCl溶液处理过的苎麻叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中。加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5ml于10 00
9、0r/min下离心12min，上清液即为SOD粗提液。2. 显色反应取试管（要求透明度好）4支，1支为对照管，另3支为测定管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.2mol/L 磷酸缓冲液1.5ml, 130mmol/L Met溶液0.3ml, 750mol/L NBT溶液0.3ml,100mol/L EDTANa2液0.3ml，20mol/L 核黄素0.3ml,蒸馏水0.25ml和0.05ml酶提取液，对照管以缓冲液代替酶液;总体积为3.0ml。各管于4 000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。列表如表1:表1.试剂用量表试 剂
10、（酶）用量(ml)终浓度（比色时）0.2mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol750mol/L NBT溶液0.375mol100mol/L EDTA-Na2液0.310mol20mol/L核黄素0.32.0mol酶 液0.05空白加缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.03. SOD活性测定与计算至反应结束后，以未加酶液处理的对照管做空白，分别在560nm测定其它各管的吸光度值。(四)结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。 SOD总活性(ACKAE)V/(ACK0.5WVt) 公式(1)式中SOD总活
11、性以每克鲜重酶单位表示；ACK照光对照管的吸光度,AE样品管的吸光度；V样品液总体积（ml）；V t测定时样品用量（ml）；W样鲜重（g）。实验四 过氧化氢酶活性的测定过氧化氢酶活力的测定在本次实验中采用高锰酸钾溶液滴定法21。(一)原理 过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。CAT酶活性的大小可用一定时间内分解的H2O2 量来表示.在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过
12、氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量：5H2O2 +2KMnO4+4H2SO45O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 (二)材料、仪器设备及试剂1. 材料：新鲜苎麻叶片2. 仪器设备(1) 研钵；(2) 三角瓶；(3) 酸式滴定管；(4) HH-4数显恒温水浴(30)(国华电器有限公司)；(5) 容量瓶(250ml)；(6) 试管数支；(7) AL204电子天平(梅特勒-托得多仪器(上海)有限公司)。2. 试剂(1) 10%H2SO4（自配）；(2) 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液(自配)；(3) 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4 3.160g，用新煮沸冷却蒸馏水
13、配制成1 000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定；(4) 0.1mol/L H2O2：取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1 000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；(5) 0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O42H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1 000ml。(三)实验步骤1. 酶液提取取 叶片2.5g(去叶脉)加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，10 000r/min离心12min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。2. 显色反应取50ml三角瓶4个（两个测定，两个对照），测定加入酶液2.5ml，对照为煮死酶液2.5ml；再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计算时间，于30恒温水浴中反应10min，立即加入10%H2SO4 2.5ml。然后用0.1mol/L KMnO4滴定，至出现粉红色（30秒内不消失）为终点。(四)结果 酶活性用每g鲜重样品10min内分解H2O2的mg数表示：过氧化氢酶活性（H2O2mg/g/min）（AB）VT/(WVS1.7) 公式(2)式中：A对照KMnO4滴定ml数；B酶反应后KMnO4滴定ml数；VT提取酶液总量（ml）；VS反应时所用酶液量（ml）；W样品鲜重（g）。
