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1、 河北农业大学本 科 毕 业 论 文题 目：刺萼龙葵生物碱分离及对小菜蛾毒力测定的初步研究学 院： 植物保护学院学 生 姓 名： 专 业：植 物 保 护 班 级 学 号：2011032010116指导教师姓名： 指导教师职称：教 授 刺萼龙葵生物碱分离及对小菜蛾毒力测定的初步研究 （河北农业大学 植物保护学院 保定 071000）摘要：本实验研究了刺萼龙葵中生物碱对小菜蛾的杀虫活性，并对其活性成分进行了提取分离。结果表明，对刺萼龙葵种粉95%乙醇粗提物中的生物碱进行小菜蛾毒力测定时，药膜法对小菜蛾的毒力测定效果比用浸渍法要好，小菜蛾的校正死亡率达26.71%；方案一、方案二分离后的生物碱对小菜
2、蛾的杀虫活性均有提高，小菜蛾的校正死亡率分别为36.37%、31.82%，方案一对刺萼龙葵中生物碱分离效果比方案二要好。关键词：刺萼龙葵；生物碱；分离；小菜蛾；毒力测定；A preliminary study of separation of alkaloid of Solanum rostratum Dunal and virulence test against Plutella xylostellaStudent:Zhao yanxingAdvisor:Zhang Jinlin(Agriculture University of Hebei Baoding 071000)Abstract
3、: This paper have studies the insecticidal activity of alkaloids of the Solanum rostratum Dunal against the Plutella xylostella ,and the extraction and separation of its active ingredients.The results showed that when use alkaloids of 95% ethanol crude extraction of the Solanum rostratum Dunal for v
4、irulence test of Plutella xylostella,The pellicles law is better than Impregnation method when dovirulence determination to the Plutella xylostella ,the Plutella xylostella corrected mortality was 26.71%；insecticidal activity against the Plutella xylostella of separated alkaloids increased both in t
5、he program one and program two ,option one:the Plutella xylostella corrected mortality was 36.37%;option two:the Plutella xylostella corrected mortality was 31.82%,therefor, program one is better than Option two in the separated effect of alkaloid of Solanum rostratum Dunal.Keywords:Solanum rostratu
6、m Dunal;Alkaloid;Separate; Plutella xylostella;Virulence test1引 言人类赖以生存的生态环境与世界人口日益增长的需要决定了化学农药仍然是人类用于控制病、虫、草等有害生物为害的一项重要手段，并在农林生产的发展中起着积极的作用1。但由于人类广泛并大量使用化学农药，有害生物的抗药性已成为病、虫、草等有害生物防治所面临的严峻挑战。尤为突出的是，由于化学杀虫剂的广泛使用而导致害虫抗性的问题十分严重，为解决害虫的抗药性问题，人们开始利用新型杀虫剂。由于植物源杀虫剂不产生抗性、无药害、有肥效、对作物生长有刺激作用、可兼治病虫害，而且取自自然，用于自
7、然，能迅速降解，无环境问题，有高选择性，对人畜安全等优点，并且随着IPM理论、可持续发展战略的实施，市场上对植物源农药等无公害农药需求日趋迫切。因此，植物源农药的研究与开发日益受到人们的重视。目前，植物源农药研究的主流在于为创制新农药探索具有生物活性的先导化合物，这是一项要求刻意创新、追求原始性创新的工作。植物在与昆虫协调进化过程中产生了许多次生代谢物质，如生物碱。植物次生代谢物质在防御害虫侵害和调节植物本身以适应其生存环境方面起着重要作用。选择开发天然植物次生代谢物质，如研究各种外来入侵植物以及从大量的药用植物的次生代谢物质中筛选出对害虫有较好杀灭作用同时对非靶标生物安全、对环境友好的次生代
8、谢物质作为植物保护剂的原料，是保护植物免遭害虫侵害、克服害虫抗药性、避免环境污染的有效途径之一，有重要的理论意义和广阔的应用前景。1.1刺萼龙葵的形态特征刺萼龙葵（Solanum rostratum Dunal）又名堪萨斯蓟、黄花刺茄，英文名buffalobur、Kansas thistle或prickly night- shade等，是茄科（Solanaceae）茄属植物2，一年生杂草，植株高50 - 60 cm；通体自地茎绿色部位起除花瓣外都密布淡棕色的硬刺及星状毛，茎直立、多分枝，株形似茄秧；叶单片互生羽状不规则深裂，叶两面具刺，以中脉和叶柄处较多；总状花序生于叶腋外，花冠5，黄色，辐射
9、对称；花萼5，密被星状毛，筒钟状；雄蕊异形，大雄蕊1枚，小雄蕊4枚；雌蕊1，子房球形2室。果实为浆果椭圆球形，绿色，包被于具尖刺的宿存萼片内，成熟时黄褐色3。果实内含种子多数。种子不规则肾形，厚扁平状，黑色或深褐色4。1.2刺萼龙葵的来源与分布刺萼龙葵是新热带区和美国西南部的本土种，该种适生性极强，生长快而健壮。适生于温暖气候条件下的砂质土壤，在干硬或潮湿的耕地中也能正常生长，耐瘠薄、干旱，在牲畜栏里也能生长。由于该物种的入侵性很强，目前已在美国、加拿大、墨西哥、俄罗斯、韩国、孟加拉国、奥地利、保加利亚、捷克、斯洛伐克、乌克兰、德国、丹麦、南非、澳大利亚和新西兰等10多个国家和地区发生5-8。
10、刺萼龙葵在美国被列为有害杂草，在加拿大被列为入侵植物，被俄罗斯列为境内限制传播的检疫杂草9。我国农业部植物检疫研究所早在1982年就在辽宁省朝阳县进行了报道，并将它列为限制输入的检疫杂草。随后在东北吉林、河北及北京等地也相继发现了该植物10。1.3刺萼龙葵的为害刺萼龙葵是一种重要的外来入侵性植物，其入侵性很强。入侵物种可导致本地生物多样性的减少和生态系统的破坏，并带来严重的经济损失11。刺萼龙葵适应性强，生长快，分布广，与本地物种争夺阳光、营养、水分和生存空间，对作物具排挤性危害，可导致土地荒芜。主要危害小麦、玉米、棉花和大豆等农作物12-13，也降低草场质量14。刺萼龙葵不仅严重影响入侵地生
11、态系统多样性，同时还能伤害家畜、影响生活和农事操作14。刺萼龙葵全株具刺，能够直接对人和牲畜造成伤害，对绵羊羊毛质量有破坏性影响15-7;并能产生对中枢神经系统尤其对呼吸中枢有显著麻醉作用的神经毒素茄碱；茄碱的毒性高，牲畜食用后中毒症状为身体虚弱、呼吸困难、全身颤抖等，死于果实中毒的牲畜常表现为涎水过多的症状13。同时刺萼龙葵是马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）、马铃薯金线虫(Heteroderarostochiensis)的重要寄主和马铃薯卷叶病毒（PLRV）的寄主，其中马铃薯甲虫作为中国一类危险性有害生物16。1.4研究目的及意义近年来，小菜蛾的抗性问题越来越
12、严重，给农业防治造成了很大困难。小菜蛾属鳞翅目菜蛾科，主要危害十字花科蔬菜。在夏季多雨年份发生较轻，而在少雨年份特别是十字花科蔬菜种植面积大、复种指数高的地区小菜蛾发生严重。1龄幼虫潜叶钻食叶肉，2龄幼虫啃食叶肉残留上表皮，成为透明的斑块。在留种田除取食嫩叶外还啃食嫩茎、钻食幼荚、食空种荚，伤口易腐烂并引发病害，严重影响蔬菜的商品性，严重发生时，造成蔬菜减产甚至绝收，对蔬菜生产形成很大威胁。为解决害虫的抗性问题，人们开始寻找适宜的植物源杀虫剂。刺萼龙葵的次生代谢产物生物碱是其杀虫活性的主要成分。植物的次生代谢是指有些生物体利用某些初生代谢产物为“原料”，在一系列酶的催化下，形成一些特殊的化学物
13、质的过程，这些特殊的化学物质即为次生代谢产物18。植物次生代谢产物可分为苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、萜类、甾体及其甙、生物碱七大类18-21。生物碱的主要类型有:有机胺类(麻黄碱、益母草碱、秋水仙碱)、吡咯烷类(古豆碱、千里光碱、野百合碱)、吡啶类(菸碱、槟榔碱、半边莲碱)、茛菪烷类(阿托品、东茛菪碱)、咪唑类(毛果芸香碱)、喹唑酮类(常山碱)、 嘌呤类(咖啡碱、茶碱)、甾体类(茄碱、浙贝母碱、澳洲茄碱)、二萜类(乌头碱、飞燕草碱)、其他类(加兰他敏、雷公藤碱)。生物碱在植物体内的分布，往往是集中在某一部分或某一器官，是许多药用植物的有效成分，目前临床应用主要表现为抗癌、抗肿瘤、抗病毒、抗
14、菌、抗炎作用。一些生物碱因其具有防治病虫害等作用，被开发为植物源农药产品，成为近年来研究的新热点。据本实验室前期研究，发现刺萼龙葵的次生代谢产物生物碱对小菜蛾有杀虫活性，因此，在其基础上本实验对该生物碱进行了粗提取、分离，希望寻找到对小菜蛾有杀虫活性的具体生物碱类别，为开发防治抗性小菜蛾植物源杀虫剂进行了探索。1.5生物碱提取与分离一种植物中往往含有几种或几十种生物碱。因此，提取出来的总生物碱还需进一步分离，去除杂质、排除干扰物，保证分析结果的准确性。近年来，应用不同的溶剂探索出以下4种提取生物碱的方法：水提取法、酸性水溶液提取法、碱性水溶液提取法和有机溶剂提取法。生物碱的分离方法也很多，既有
15、经典的分离方法，如溶剂萃取法、蒸馏法、沉淀法、盐析法、结晶法、膜渗透升华法等；也有现代较为先进的分离方法，如色谱分离法。现把几种常用的方法介绍如下：硅胶柱色谱分离法，硅胶层析柱适用范围广，既能用于非极性生物碱也能用于极性生物碱，且成本低，操作方便，是常见的生物碱的分离方法。Al2O3柱色谱分离法，以Al2O3作为填料的层析分离法，适合于酸性大、活化温度较高的生物碱的分离。大孔树脂分离法，用大孔树脂分离提取生物碱，已有较多的研究。离子交换树脂分离法，已应用于生物碱的分离提取中。离子交换技术设备简单，操作方便，具有生产周期短、能源省、成本低、产品纯度高、不吸潮、不加辅料就可以成型等优点。高速逆流色
16、谱分离法，高速逆流色谱分离法是一种新的分离技术，它对生物碱的分离和制备具有很大的优势，特别是对进样量较大的样品具有独特的优点，其应用前景越来越引人注目22。本研究对刺萼龙葵的有效杀虫成分-生物碱进行了提取、分离，并对其进行了小菜蛾毒力测定，为进一步利用刺萼龙葵的化学成分开发天然产物农药提供理论依据。2. 材料与方法2.1 供试材料2.1.1 供试昆虫小菜蛾（Plutella xylostella）在养虫室（温度251，湿度70%，光照14 h，黑暗10 h）用蛭石培养的萝卜苗饲养。2.1.2 供试植物 刺萼龙葵（Solanum rostratum Dunal）采收于河北省张家口市万全县。2.1.3 供试试剂 甲醇、9
