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1、实验五 鸡蛋清中卵类粘蛋白分离纯化及活性测定一、实验目的和要求1) 设计从鸡蛋清中分离纯化卵类粘蛋白的试验方案。2) 设计从鸡蛋清中分离纯化卵类粘蛋白的试验操作条件。3) 了解离子交换层析系统中四大组成部分和实验主要影响因素。4) 掌握熟离子交换层析层析仪的使用方法和注意事项。5) 学会凝胶预处理和装柱、平衡、洗脱的方法。二、器材和试剂1实验器材：层析系统 LH-2 ，(包括自动部分收集器，紫外检测仪，记录仪，蠕动泵，梯度混合器)6 套；高速离心机；布氏漏斗；烧杯 500ml,100ml ，各 16 个；移液管 1、 2、5ml, 各 16 个； 量筒50ml,100ml，各16个；真空干燥器
2、4个；滴管，16个；滤纸$ 120, 1盒；2实验试剂：(1) 丙酮； (2)1 ， pHl.15 的三氯乙酸：将称取的三氯乙酸置烧杯内，加入23 总体积的蒸馏水溶解，用6mol/L氯氧化钠调至约 pHl.15，静置约1h,然后在pH计上校正至pH 1.15 ，最后补充水到所配体积； (3)0.02 mol L,pH6.5 ，磷酸盐缓冲液； (4)0.5mol L 氯化钠一0.5mol / L氢氧化钠溶液；(5)0 . 5mol/L盐酸溶液；(6)0.3mol/L 氯化钠一0.02mol /L磷酸盐缓冲液，pH6.5 ； (7)底物缓冲液：0.05mol / L, Tris-HCI缓冲液，pH
3、8.0，内含 2.22mol /L的氯化钙；(8)2mmol / 1,BAEE底物：用底物缓冲液配制；(9)lmg / mL胰蛋白酶溶液：用 0.001 mol / L 盐酸配制；(10)DEAE-纤维素粉(DE-32) ； (11)SphadexG-25 ； (12) 鸡蛋 30 个；( 13)1 硝酸银三、实验原理1 蛋清中蛋白质结构组成为：卵清蛋白、卵转铁蛋白、卵类粘蛋白、卵粘蛋白、溶菌酶、G、G3球蛋白、卵抑制素、卵糖蛋白、黄素蛋白、卵巨球蛋白、蛋白抑制剂、抗生物素蛋白。2. 鸡卵类粘蛋白(chickenovomucoid , CHOM的性质：鸡卵类黏蛋白(chickenovomuco
4、id , CHOM是由鸡卵清中制得的一种糖蛋白，可强烈地抑制胰蛋白酶， 对枯草芽孢杆菌蛋白酶也有一定程度的抑制作用， 但对胰凝乳蛋白酶无抑制作 用，对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。 常用于胰蛋白酶酶学性质的研究。 也可将其制成 亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效地分离与纯化胰蛋白酶。鸡卵类黏蛋白至今还未能获得单一组分的制品，目前至少已获得 4 种不同组分， 它们在抑制胰蛋白酶的性能上和氨基酸组成上差别不大，但是在糖基部分（主要为D-甘露糖、D-半乳糖、葡萄糖胺和唾液酸 ）的含量有差别。由于 Ovomucoid 所带的糖基不同，电泳行为呈现 出不均一性，其 pI 大致在 3.9-4.5 ，相对分
5、子质量 28 000 ，卵类黏蛋白抑制胰蛋白酶的摩 尔比为 1： 1。卵类黏蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都相当稳定，而在碱性溶液中不稳 定，尤其是当温度较高时会迅速失活。 Ovomucoid 带有四种糖基，因此有较强的吸水性。在 50%丙酮或5%三氯乙酸盐的水溶液中，仍有较好的溶解度。所以，选择合适的pH,丙酮浓度和三氯乙酸盐的浓度，可以从蛋清中除去大量的非卵粘蛋白。Ovomucoid在280nm处的百分消光系数 A1%1cm. 280 = 4.13 ,即蛋白酶浓度为 1mg/ml 时,溶液的吸光度 A280 = 0.413 ,据此可 以测定其溶液中蛋白质的含量。本实验主要参照 Ka
6、ssell 的方法,鸡蛋清经三氯乙酸 （TCA） 丙酮溶液处理,除去沉淀物，然后经丙酮分级沉淀获得粗晶，再用DEAE纤维素柱层析纯化而得合格产品。四、实验步骤1鸡卵类黏蛋的提取取50mL鸡卵清，加入等体积的 10%, pH1.15三氯乙酸溶液（缓缓加入以防局部过酸出 现块状物），形成类似于酸奶状的白色沉淀，轻轻地搅拌均匀。在酸度计上检查最终 pH值应为大约3.5，若pH值偏离3.5 0. 2则要用5mol/L氢氢化钠或5mol/L盐酸调节pH值， 由于提取液非常稠，在调节pH值时防止局部过酸或过碱。pH值调好稳定后，在室温下静置4h以上。待卵清清蛋白完全沉淀后，以3000r / min离心10
7、min。弃去沉淀物，上清液用滤纸过滤，以除去上清液中脂类物质及其他不溶物。收集滤液转入500mL的烧杯内。检查滤液的pH值是否为3.5，否则要调回到pH3.5。置冰浴或冰箱内冷却片刻，缓慢加入3倍体积预冷的丙酮，用玻璃棒轻轻搅匀，用塑料薄膜盖好封严，在冰浴里放置24h,待鸡卵类黏蛋白完全沉淀后，小心虹吸出一部分上清液，剩余的部分全部转移到50mL带盖的离心杯里，加盖经平衡后以 3000r /min离心15min,除去上清，沉淀物放在真空干燥器内，抽气除去 残留丙酮。使沉淀物由白转变为透明黏稠物后停止抽气。加入20mL蒸馏水溶解，若溶解液混浊则用滤纸滤去不溶物。滤液经 SephadexG-25
8、柱层析法脱盐或者经透析除盐。2.鸡卵类黏蛋的脱盐用 SephadexG-25 柱层析法脱盐的操作如下：称取30gSephadexG-25，用500mL0.02mol/ L, pH6.5的磷酸盐缓冲液在 100 C热溶胀2h或者室温下溶胀 24h。脱气后装柱（35mmx300mm,柱床体积约 150mL。用约2倍体积的0.02mol / L, pH6.5磷酸盐缓冲液平衡。流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线或经 紫外分光光度计测定光吸收，其As。小于0.02即可上样。取20mL鸡卵类黏蛋白提取液上柱（上样量不超过柱床体积的1/6）。用同样的缓冲液洗脱，收集第一峰，在蛋白峰完全流出后盐才开始流
9、出，盐通常在280nm无明显光吸收，若绘出第二峰则是残留丙酮峰。丙酮和盐同时流出。洗脱曲线见下图。宀1 送我冷庚前:如宀二眩 H斷梳脱截乂 为 0.02 md/Lt冲糠屠2 逆沪t舟my ：,业蛇.工洙脱曲线平0.02 mol/L. 翻砂縑益神整椎;拢脫戡匸 0.3nl/L Na-0.02 mol/L. pH6,5冲液通过上述方法获得的鸡卵类黏蛋白仍含有少量的卵清清蛋白。由于二者的等电点不同，采用DEAE纤维素离子交换层析可以将二者分开。称取10g DEAE-纤维素粉（DE-32），用150mL 0.5 mol / L氢氧化钠-0.5mol/L 氯化钠溶 液浸泡20min。用布氏漏斗（内垫为2
10、00目尼龙网）抽滤。用蒸馏水洗至 pH8. 0左右，抽干。 然后移至500mL的烧杯内，用150mL0.5mol /L盐酸溶液浸泡20min，再转移到布氏漏斗内， 抽滤，用蒸馏水洗至pH6.0左右，最后转移到烧杯内，用150mL0.2mol/L, pH6.5磷酸盐缓冲液浸泡约15min，经真空干燥器脱气后装柱。取一支层析柱（35mmx200mm装入约1/4体积的0.02mol / L, pH6.5磷酸盐缓冲液，将 处理过的DEAE纤维素装入柱内。以同一缓冲液平衡，流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳 定的基线或经紫外分光光度计测定光吸收，待A280值小于0.02即可加样。将经SephadexG-2
11、5脱盐后的鸡卵类黏蛋白溶液上柱吸附。以0.02mol / L, , pH6. 5的 磷酸盐缓冲液平衡，基线稳定后，改用 0.3mol L 氯化钠 0.2mol L，pH6.5 的磷酸盐缓冲 液洗脱，收集第二洗脱峰。柱层析图谱见上图。在鸡卵类黏蛋白液中所含的鸡卵清清蛋白， 在洗脱时可能出现一个小峰或不明显的峰形。 在这种情况下可根据峰形大小， 测定活性来确 定鸡卵类黏蛋白洗脱峰的位置。4. 鸡卵类黏蛋白纯品的制备经DEAE纤维素离子交换柱层析制得的鸡卵类黏蛋白溶液装入透析袋内，用蒸馏水进行透析，间隔一段时间更换一次蒸馏水，直至经1硝酸银检查无氯离子为止。将透析过的鸡卵类黏蛋白溶液转移到烧杯内，小
12、心地用1mol/L盐酸调节至pH4.0，取出ImL,稀释510 倍测定鸡卵类黏蛋白的含量及活性。然后加入 3 倍体积的预冷丙酮，用塑料薄膜封严烧 杯口,在冰浴里静置 4h 左右。待鸡卵类黏蛋白完全析出后,倾去上清,沉淀转移到一个带 盖的50mL离心杯内，于 3000r / min离心15min，弃上清，沉淀物放人真空干燥器内干燥， 即可得到透明胶状物 - 鸡卵类黏蛋白 （约 200300mg）。5 鸡卵类黏蛋白的含量测定配成一定浓度的鸡卵类黏蛋白溶液，测定A280。鸡卵类黏蛋白的消光系数是：A1%cm=4.13。鸡卵类黏蛋白（mg/mL）=（A28oX稀释倍数）/0.4136. 鸡卵类黏蛋白的
13、活性测定 （ 选做）鸡卵类黏蛋白的活性可以用抑制胰蛋白酶的活力单位表示。即：抑制 1 个胰蛋白酶活力单位（BAEE单位）所需卵类黏蛋白量定为抑制剂的1个活力单位。取 2 个石英比色池 （ 带盖,光程为 I cm） ,一个加入 0.05moI /L, pH80 Tris-HCI 缓 冲液和2. 0mol/L, BAEE底物溶液各1.5mL混匀，在波长253nm处调整仪器零点。另一个 比色池内加0.05mol / L, pH8.0 , Tris-HCI缓冲液1.5mL, 10卩L胰蛋白酶液（约10卩g胰蛋 白酶），10卩L鸡卵类黏蛋白（约5-10 1 g鸡卵类黏蛋白）轻轻摇匀，在室温下（最好是在2
14、5 C 恒温箱内 ） 放置 2min如蛋白酶与鸡卵类黏蛋白充分结合。然后加入2mol/L BAEE底物溶液1. 5mL,立即混匀并记时。于波长 253mn处测定其光吸收递增值 A253/ min。每隔30 s读数一次，使 A253/min值控制在0.05左右为宜，否则要根据 A253/ min的大小适当减少或增加鸡卵类黏蛋白的量。以反应时间t为横坐标，A253为纵坐标作图，取直线部分的任一时间间隔与相应的光吸收变化值为 A253/min用A表示。与此同时，以同样的方法（不加鸡卵类黏蛋白：测胰蛋白酶的活性。通过作图得到光吸收变化值 A253/ min，用A表示。鸡卵类黏蛋白的抑制活性及抑制比活性
15、的计算公式如下： 鸡卵类黏蛋白的抑制活性单位(BAEE)=(Al -A2)/0.001鸡卵类黏蛋白抑制比活单位 (BAEE单位/mg胰蛋白酶)=(AI-A2) X 1000/( AI-A2 )/1 X0.001式中A i：胰蛋白酶 A253/ min ; A2：加入抑制剂后胰蛋白酶 A253/ min ; I :测定时所用鸡卵类黏蛋白的量(卩g); 1000:将抑制剂的微克数转换成毫、克数；0.001:指吸光度每增加 0.001定义为1个BAEE单位。五、注意事项1 加入丙酮沉淀在冰浴中保持 4 小时，注意保持冰浴状态。 2层析柱下端过滤网孔径应与凝胶溶胀直径相匹配，防止漏胶或上下端压力差过大造成上 端出水。六、思考题1. 纯化蛋白质时如何选择离子交换树脂？2. 如何选择离子交换条件？3. 离子交换剂如何进行再生？4. 如何对基线进行调零？
