《考马斯亮蓝染色法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《考马斯亮蓝染色法（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、蛋白质浓度的测定一马斯亮蓝染色法目的要求学习考马斯亮蓝(CoomassieBrilliantBlue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质一染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beersla)此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm,通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现
2、最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质一染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质一染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5L/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10-100g蛋白质，微量测定法测定范围是1-10pg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。此方法干扰物少，研究表明：NaCl,KCl，MgCl2，乙醇，(NH4)2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有
3、一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如TritonX100SDS,玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。试剂与器材一、试齐U考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G-250，4.7%(W/V)乙醇。二、标准和待测蛋白质溶液1. 标准蛋白质溶液结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mo
4、l/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。2. 未知蛋白质溶液。三、器材试管及试管架，移液管(0.1ml及5ml)，UV2000型分光光度计。操作方法、标准法制定标准曲线取14支试管，分两组按下表a平行操作。绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。表a试吕编号01234561mg/ml标准蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.060.15mol/LNaCl/ml0.10.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂/ml5ml摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm二、微量法
5、制定标准曲线取12支试管，分两组按下表b平行操作。绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。表b试吕编号0123451mg/ml标准蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.15mol/LNaCl/ml0.10.090.080.070.060.05考马斯亮蓝试剂/ml5ml摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm三、未知样品蛋白质浓度测定测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/ml)。注意事项(1) 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。(2) 测定中，蛋白一染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。思考题：根据下列所给的条件和要求，选择一种或几种常用蛋白质定量方法测定蛋白质的浓度:(1) 样品不易溶解，但要求结果较准确。(2) 要求在半天内测定60个样品。(3) 要求很迅速地测定一系列试管(30支)中溶液的蛋白质浓度。
