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1、实验四 果蔬维生素C (抗坏血酸)的测定(荧光法)抗坏血酸溶于水，稍溶于丙酮与低级醇类。结晶抗坏血酸稳定，水溶液易氧化，遇空气 中氧、热、光、碱性物质，特别是在有氧化酶及痕量铜、铁等重金属离子存在时，可促进其 氧化破坏进程。酸性、冷藏、隔氧，可延缓食品中抗坏血酸的破坏。国内外用于食物中维生素C含量测定的主要方法有三种，即荧光法、2, 4二硝基苯肼 法、2, 6二氯酚靛酚滴定法。2, 6二氯酚靛酚滴定法只能测定食物中还原型抗坏血酸。由 于脱氢型抗坏血酸在人体内与还原型抗坏血酸具有同样的生理功能。在一般情况下，测定食 物中总抗坏血酸。2, 4二硝基苯肼法和荧光法都是测定食物中总抗坏血酸含量的方法。
2、2， 4二硝基苯肼法是比色法，易受杂质干扰，灵敏度较低，而荧光法的灵敏度高于比色法23 个数量级。另外，2, 4二硝基苯肼法采用85%的浓硫酸作溶剂，实验时不易操作。荧光法 利用硼酸对脱氢抗坏血酸的掩蔽作用可测出杂质的荧光值，从而提高方法的专一性。因此， 荧光法具有灵敏度较高、选择性好、易于操作等优点，但此方法易受仪器条件的限制，所以 国标方法中选用荧光法为测定食物中维生素C含量的第一标准方法，而将2, 4二硝基苯肼 法作为第二法。一、实验目的与要求1 理解食物中维生素C的分布规律以及维生素C的理化特性。2 学会用常规的比色法测定食物中维生素C的操作技巧。3 理解测定维生素C的基本原理。二、实
3、验原理1 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺(OPDA)反应 生成具有荧光的喹喔啉(quinoxaline),其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成 正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。2 脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除样品中荧光杂质所产生 的干扰。本方法的最小检出限为0.22g/ml。3 适用范围根据GB 12392-1990进行检测，本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏 血酸的测定。三、实验仪器与试剂1 仪器(1) 实验室常用设备；(2) 荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计；(3) 捣碎机。2
4、 试剂配制(1) 本实验用水均为蒸馏水，试剂不加说明均为分析纯级试剂。(2) 偏磷酸乙酸液：称取15g偏磷酸，加40ml冰乙酸及250ml水，搅拌，放置过夜使之 逐渐溶解，加水至500ml。4C冰箱可保存710d。(3) 0.15mol/L H2SO4 : 取10ml硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1200ml。(4) 偏磷酸乙酸硫酸液：以0.15mol/L硫酸液为稀释液，其余同偏磷酸乙酸液的配制。(5) 50%乙酸钠溶液：称取500g乙酸钠(CH3COONa 3H2O),加水至1000ml。(6) 硼酸乙酸钠溶液：称取3g硼酸，溶于100ml乙酸钠溶液中。临用前配制。(7) 邻苯二胺溶液：称
5、取20mg邻苯二胺，于临用前用水稀释至100ml。(8) 0.04%百里酚蓝指示剂溶液：称取0.1g百里酚蓝，加以0.02mol/L氢氧化钠溶液， 在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为10.75ml,磨溶后用水稀释至250ml。变色 范围：pH=1.2红色pH=2.8黄色pH4.0蓝色（9）活性炭的活化：加900g炭粉于1L 1 + 9盐酸中，加热回流12h,过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110120C烘箱中干燥， 备用。（10）标准液 抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）：准确称取50mg抗坏血酸，用偏磷酸乙酸液溶于50ml容 量瓶中，并稀释至刻度。 抗坏血酸标准使用液（100p
6、g/ml）：取10ml抗坏血酸标准液，用偏磷酸乙酸溶液稀释 至100ml。定容前试pH，如其pH大于2.2，则应用偏磷酸乙酸硫酸液稀释。 标准曲线的制备：取标准溶液（抗坏血酸含量10p g/ml） 0.5ml、1.0ml、1.5ml和2.0ml 标准系列，取双份分别置于10ml带盖试管中，再用水补充至2.0ml。四、实验步骤全部实验过程应避光。1 样品制备称取100g鲜样，加100g偏磷酸乙酸溶液，倒入打碎机内打成匀浆，用百里 酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度。如呈红色，即可用偏磷酸乙酸溶液稀释，若呈黄色或蓝色，则 用偏磷酸乙酸硫酸溶液稀释，使pH为1.2，匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定。
7、当样品液含量在40100p g/ml之间，一般取20g匀浆，用偏磷酸乙酸溶液稀释至100ml， 过滤，滤液备用。2 氧化处理分别取样品滤液及标准使用液各100ml于带盖三角瓶中，加2g活性炭，用力 振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即样品氧化液和标准氧 化液，待测定。3 各取5ml标准氧化液于2个50ml容量瓶中，分别标明“标准”及“标准空白”。4 各取5ml样品氧化液于2个50ml容量瓶中，分别标明“样品”及“样品空白”。5 于“标准空白”及“样品空白”溶液中各加5ml硼酸乙酸钠溶液，混合摇动15min，用 水稀释至50ml，在4C冰箱中放置2h，取出备用。6 于
8、“样品”及“标准”溶液中各加入5ml 50%乙酸钠溶液，用水稀释至50ml，备用。7 荧光反应：取“标准空白”溶液、“样品空白”溶液及上一步中“样品”溶液各2ml， 分别置于10ml带盖试管中。在暗室中迅速向备管中加入5ml邻苯二胺，振摇混合，在室温 下反应35min，用激发光波长338nm、发射光波长420nm测定荧光强度。标准系列荧光强度 分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行 相关计算，其直线回归方程供计算时使用。五、实验结果与分析x =p VmXfX 101000式中：x样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量（mg / 100g）；p 由标准曲线查
9、得或由回归方程算得样品溶液浓度（|J g/ml）；m试样质量（g）；f样品溶液的稀释倍数；V荧光反应所用试样体积（ml）。【例】测定每一制备溶液的荧光强度。用标准溶液每1ml含2.5、5.0、7.5p g及10p g样 品，各标准浓度管读数减去相应的标准空白读数的各平均值作标准曲线。由样品液读数减去样品液空白读数之值，从标准曲线上查得相应的抗坏血酸（|J g/ml），按取 样量及稀释率计算样品中抗坏血酸的含量。如：取制备好的辣椒样品工2.138稀释到100ml，氧化后分别取10ml滤液稀释到50ml，样 品读数为23.34，样品空白读数为3.188，样品读数减去样品空白读数为20.152，查荧
10、光标 准曲线相当于标准抗坏血酸的 2.23|J g。2.23X 1002.138X5010X 1001000 = 52 （mg/100g）六、实验报告七、注意事项1 大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用 新鲜样品并尽快用偏磷酸乙酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素C。2 某些果胶含量高的样品不易过滤，可采用抽滤的方法，也可先离心，再取上清液过滤。3 活性炭可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，但它也有吸附抗坏血酸的作用，故活性炭 用量应适当与准确，所以，应用天平称量，我们的实验结果证明，用2g活性炭能使测定样 品中还原型抗坏血酸完全氧化为脱氢型，其吸附影响不明显。
