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1、药理学实验II （细胞药理学）07102127 唐超本次实验一共分三个内容，分别是细胞计数、药物溶剂在hela细胞中的毒性和细胞传 代。实验一、细胞的计数 操作步骤：1、用移液管吹打MT-4悬浮细胞制成细胞悬液。2、取清洁的血球计数板，盖上盖玻片，取少许上述混合液（约 15 微升）从盖玻片边缘加入， 弥散至整个槽面，避免产生气泡。3、镜下计数四个大方格的细胞总数，除以4，再乘以稀释倍数，最后乘以10000，为每毫升 细胞悬浮液中的细胞数。注意事项：1、每一大个体积为 1 立方毫米。2、若细胞位于线上，计数的原则是：记上不记下，记左不计右。实验二、药物、溶剂在Hela细胞中的毒性实验 实验目的：
2、1、掌握在细胞水平测试药物或溶剂对细胞的毒性实验设计及操作技术。2、掌握 CCK-8 法测定细胞活力的原理和方法。3、掌握药物细胞半数中毒浓度（TC50）的计算方法。 材料和试剂：1、细胞：Hela细胞2、样品：甲醇、乙醇、DMSO、待测样品X （每组做两种样品）3、CCK-8溶液、DEME完全培养基4、酶标仪、96孔培养板、微量移液器、CO2培养箱、倒置显微镜等 操作步骤：1、稀释溶液： 1:1、 1:2、 1： 4、 1:8、 1:16、 1:32、 1:64、 1:128、 1:256九个浓度，每个稀释 度四个复孔，每孔加样100微升。2、稀释待测样品 X： 1:10、 1:20、 1:
3、40、 1:80、 1:160、 1： 320、 1:640、 1:1280、 1:2560、 1:5120、 1:10240十一个稀释度，没个稀释度4个复孔，每孔加样100微升。3、取前一日接种Hela细胞的96孔板，细胞接种密度为6000/孔。4、弃去培养基，加入100 微升上述稀释的溶剂或待测样品。5、设立细胞对照，弃去培养基，加入100微升培养基。6、于37摄氏度，5%CO2培养箱，逐日观察细胞形态。7、第三天，每孔加入10微升CCK-8溶液，轻轻拍打培养板混匀。37摄氏度孵育1-4ho8、酶标仪测定450nm/630nm处的A值。结果判定1、计算各稀释度药液组成的A均值。2、以A均值
4、为纵坐标，药物稀释倍数的对数为横坐标绘制散点图，计算回归方程。3、计算药物的半数中毒浓度（TC50）o实验三、哺乳动物细胞的传代（实验演示）实验目的： 掌握哺乳动物细胞传代培养基本操作步骤。材料和试剂：1、培养中的Hela细胞、MY-42、倒置显微镜、移液管、离心管、培养瓶等3、RPMI1640培养基、DMEM培养基、无菌PBS、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液 等。操作步骤：1、将成长单层的Hela细胞从二氧化碳培养箱中取出，在生物安全柜中弃掉瓶内的培养基， 用无菌PBS洗涤细胞一次，加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液，37摄氏度作用 三到五分钟。2、倒置显
5、微镜下观察，当细胞将要分离而成圆粒状时，轻轻吹打瓶壁使细胞脱落，反复吹 打使细胞分散均匀。3、将细胞悬浮液依比例转移到另一无菌培养瓶中，并向每个瓶中加入约5毫升培养基，吹 打摇匀。拧紧瓶塞，放回二氧化碳培养箱中继续培养。悬浮细胞1、吸出细胞培养液、放入离心管中，1000rpm离心5分钟。2、吸取上清液，加入适量完全培养基，混合均匀后，以稀释比例转移至新的培养基瓶中， 吹打混匀， 37 摄氏度， 5%二氧化碳培养箱中继续培养。实验数据分析：123456789100.180.160.540.620.861.48吸光度（A）0.0050.1510.2169181530.1410.180.270.45
6、0.710.872.070.0060.1480.1749247270.1370.170.250.050.590.941.390.0040.1590.1595575460.1470.160.290.410.752.700.0051.1421.14223151.0890.150.170.240.360.670.941.91平均数（A）0.0050.40.422758755257520256250.14375细胞浓度（万空白2.343954.68750.931.873.757.515300/ml)755DMS01234567891011121.30.92.41.81.31.90.41.5吸光度（A）
7、2.1621.3551.696686436873567052.0720.90.11.21.51.51.92.01.61.540.0851.26135230798318646851.4311.21.62.31.82.20.81.81.1910.7251.0031581871.7399744161.8521.41.11.11.40.92.31.21.71.4361.3840.8337404225879507651.3271.62.11.6平均值（A）0.88721.19671.20.91.71.41.11.5822555466994539736532419271.670555518.13.28.2
8、5.22.34.16.26.细胞浓度24.62108012.51317.90576393731862207356893354626.1585365（万/ml）139066202052265066282815822170815797167852022333137323319092470.20.4-0.-0.0.1-0.0.3-0.抑制率0.49170.2727379339150040034404122078-0.06244470742791755174267288185686848033235188195916464587374236175325698157273051981641412待测样品
9、X123456789101112吸光度（A）0.10.21.11.31.30.81.21.41.6150.1940.148194709481958671.6790.10.30.91.01.21.21.11.90.111 （遗1.6550.1640.1783708134185444564弃）0.10.21.21.21.52.22.11.31.7860.1940.1252935508110763411.7520.10.31.41.11.31.11.51.21.6820.1970.19353338496164426081.1590.10.21.11.11.31.31.4平均值（A）0.18721.5
10、1.684550.16132295290298257761239571.535555555细胞浓度26.4024390.3179-0.139-0.2.117.17.20.20.23.23.23.7108013厂 |汁（.I-: :二 II.rlu.5r.-2302DO-5 O(万/ml)0244425083728226409947919317097707101149473243773811184930905801111902519847669314923394498440.90.30.30.20.10.11.00.2抑制率0.98791.00522421662612081561320192450.10194655057769778785949494129951205495946546321412266038990411064185215413913490.00.00.00.00.00.0药物稀释倍0.00.0007003001数00.10.05251250620310158129069539.7657E-05525625525125-1.-1.-2.-2.-2.-3.-3.-3.药物稀释倍无-1.301602
