开题报告-山羊妊娠黄体的细胞学构筑及其

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1、山羊妊娠黄体的细胞学构筑及其与卵泡生长发育的关系1论文选题的目的及意义黄体是哺乳动物排卵后由卵泡的颗粒细胞和内膜细胞所形成的一个暂时性内分泌 器官，在一个较短的存在期限中经历了一系列的结构变化和分泌活动，在调节维持妊娠 中起着至关重要的作用。本研究拟运用常规组织学制片技术和透射电镜技术对处于不同 妊娠期（前期、中期和后期）关中奶山羊的黄体组织的显微和超微结构进行详细观察， 确定其细胞分型、各型的结构特征及不同时期的细胞学变化规律；并结合卵巢各级卵泡 的数量和直径变化的组织形态观察测量和统计分析，探讨卵巢黄体对各级卵泡生长发育 的影响，为合理调控山羊繁殖和进行山羊胚胎移植等应用技术提供依据。2选

2、题的依据2.1理论依据由于黄体是一个调节发情周期和维持妊娠的重要内分泌器官，长期以来，有关黄体 的生理学和神经内分泌学研究一直受到重视。本实验依托下丘脑-垂体-卵巢轴催产素的 分布研究，结果表明在发情周期和妊娠期黄体组织中均有催产素的分布，大、小黄体细 胞均可出现阳性反应，但未能揭示阳性产物在两型黄体细胞中的颗粒分布及差异；以及 随后开展的黄体中弥散性神经内分泌细胞的相关研究显示5-HT、NSE（神经元特异性烯 醇化酶）和SYN（突触素）共存于山羊黄体细胞中，而在黄体细胞以外的卵巢细胞中未观察 到该现象，说明羊的卵巢发生黄体化的同时也存在着部分细胞的神经内分泌化，但仍未 明确揭示这些标记物到底

3、共存于哪一类型黄体细胞，也未说明在不同生理时期这些标记 物的分布变化。由此可见，有关黄体组织细胞构成、分型及各型结构特征的认识对于黄 体神经免疫内分泌学研究及相关应用研究都有着十分重要的意义。通过文献资料的查阅及先期工作的基础，对妊娠期关中奶山羊的黄体组织的显微和 超微结构进行详细观察，确定其细胞分型、各型的结构特征及不同时期的细胞学变化规 律；并结合卵巢各级卵泡的数量和直径变化的组织形态观察测量和统计分析，探讨不同 生理期卵巢黄体对各级卵泡生长发育的影响，在理论上完全可行。2.2技术依据实验材料可从西安和周边的屠宰场采集，来源充足；动物组织胚胎学实验室具备完 善的组织制片仪器设备，光镜制片技

4、术方法娴熟，实验室还可完成电镜制样过程，学校 测试中心电镜室可以进行透射电镜切片及观察分析。这些都对项目的顺利实施提供了有 利的保障。本人具备较扎实的动物组织胚胎学理论和组织切片观察能力，能熟练的运用 光镜观察各种组织的形态，具备动物组织制片和电镜制样的理论基础，并能运用相关的 统计分析软件对实验数据进行相关处理和分析，对研究的顺利完成提供了保障。2.3前期工作本实验在前人研究的基础上，研究不同生理期山羊黄体组织形态及其对卵泡生长 发育的关系，本实验已进行前期的准备工作，从不同屠宰厂区取6-21胚龄的胎儿（按 体长分为妊娠前期、中期、后期），取出卵巢。3国内外研究概况近年来，有关黄体细胞的功能

5、和退化、溶解机理等也有较多资料报道，研究表明不 同动物黄体细胞的功能各不相同，黄体退化、溶解与细胞凋亡有密切关系，但由于动物 种类不同，加上研究方法各异，使得研究者对黄体细胞的来源、组成、形态及大小均持 有不同的观点，这极大阻碍了进一步开展黄体细胞的功能学和体外分离培养研究1。3.1黄体的形态生理学3.1.1黄体起源的研究早在十九世纪末至二十世纪初，人们对黄体形成的卵泡细胞类型就存在两种假设（Hansel等，1987），一种认为黄体直接来源于卵泡颗粒细胞，这些细胞在排卵后不久 由卵泡内膜变性而来；另一种观点认为，黄体的形成与卵泡内膜及颗粒层都有关。现 较公认的观点认为：黄体的发育与卵泡膜和颗粒

6、层都有关系，但他们与黄体特殊细胞类 型的关系尚不清楚。MeNuTT在1924年和1927年分别对发情妊娠期间黄体进行了研究后指出：尽管黄体 细胞来源于内膜细胞和颗粒细胞，但许多细胞显示出过度的特点，因此不能确定它的起 源。许多研究也证实了这些发现，并补充了有关不同类型细胞实质方面的详细资料。这 些研究表明至少存在2种黄体细胞，并且较大的细胞来源于颗粒细胞，而较小的来源于 卵泡内膜细胞4。3.1.2黄体的形成和发育接近成熟的卵泡由于卵泡液不断增多，体积更大，颗粒膜及卵泡膜表薄，部分突出 于卵巢表面，突出部分的卵巢膜也渐变薄，并出现卵圆形透明小区，称小斑，此时，卵 泡液及卵泡壁的胶原酶，透明质酸酶

7、活性增强，分解卵泡壁及卵巢的白膜，小斑处首先 破裂，卵细胞及其周围的放射冠随卵泡液一起排出，完成排卵。排卵后，卵泡壁塌陷形成皱襞（猪和牛咋排卵前，成熟卵泡壁即出现皱襞），卵泡 膜血管受伤出血，使卵泡腔内充满血液及一些浆液性含纤维的液体，称为血体。随着基 膜的崩解，卵泡内膜的血管增生并伸入颗粒层内，血液逐渐被吸收，在垂体远侧部分泌 的LH作用下，颗粒层细胞增大变为多角形，胞质内出现类脂颗粒，形成粒性黄体细胞； 卵泡内膜细胞也发生类似的变化，形成体积较小，核和胞质着色较深的膜性黄体细胞， 至此，血体转变为黄体（corpus luteum）膜性黄体细胞多位于黄体内由结缔组织形成 的小梁周围或黄体周缘

8、。黄体细胞成团或索状排列，富于毛细血管的结缔组织夹于其间， 卵泡外膜包在黄体的外周形成黄体被膜留，刀。黄体形成后发育极快，如未妊娠，黄体则逐渐退化，此种黄体称假黄体，如已妊娠， 黄体在整个妊娠继续维持其大小和分泌功能，此种黄体称真黄体。不同动物的黄体在发 情后退化时间不一。由于子宫内膜分泌胎盘促性腺激素，卵巢因此受到刺激而形成大卵 泡。这些卵泡多数排卵并形成继发黄体；少数不排卵而黄体化。继续黄体大约维持妊娠 180天，以后逐渐变性，在妊娠的其余时间内，没有黄体存在。真假黄体完成其功能后， 即行退化，成为白体。3.1.3黄体的功能黄体是内分泌器官，可分泌孕酮及雌激素，一般认为孕酮由粒性黄体细胞分

9、泌，雌 激素由膜性黄体细胞分泌。研究表明黄体还能产生几种肽类和类固醇类激素:如OT、松 弛素、17。一雌二醇、睾酮及前列腺素等。但黄体的主要功能是合成和分泌孕酮，孕酮 对生殖系统有重要的作用，可促使子宫腺分泌子宫乳及乳腺发育，为维持妊娠做好准备。 在发情周期的黄体期，高水平的孕酮能抑制子宫的收缩并刺激子宫内膜特别是子宫内膜 腺体的生长和发育，孕酮对大多数哺乳动物的妊娠维持必不可少，至少在怀孕1/3阶段， 在妊娠期摘除黄体即发生流产。孕酮还可以刺激乳腺的生长发育，特别是对小叶一腺泡 的发育。3.2黄体的形态学特点3.2.1大、小黄体细胞的起源Hansel等（1987）认为，黄体中存在三种主要细胞

10、类型：1）小的（10队）非类 固醇生成细胞，主要包括血管细胞（如内皮细胞、红细胞和白细胞）和结缔组织细胞如 成纤维细胞；2）小的类固醇生成细胞（10-20 m）； 3）大的类固醇生成细胞（25p m）. 许多研究表明，黄体来源于卵泡的两种细胞类型：颗粒层细胞形成大黄体细胞，而卵泡 细胞产生小黄体细胞9.10。人们普遍认为，大黄体细胞（Large luteal cell,LLC）只源于颗粒细胞，而小黄体 细胞（Small luteal cell,SLC）仅来源于卵泡的内膜细胞。然而，已有证据表明，SLC 可以转变为LLC；随着黄体日龄的增加,LLC还可以分化为SLC。也有实验表明，LLC和SLC

11、 各有不同的来源，在整个黄体期并未发生分化和转变。绵羊SLC大小始终保持不变，但 数量增加。LLC数量不变，但体积增大。尽管SLC/LLC数量比例在整个黄体期逐渐增加， 但这两种细胞在黄体中所占的体积基本恒定。由于在多数实验研究中，大小细胞的分类 主要根据其形态和大小，在黄体发育早期，两种细胞大小差别不明显，那些用特异性 细胞膜抗体试验认定为是由SLC转变成的LLC，可能本身就是在黄体早期体积较小，而 本身具有LLC特性的细胞。3.2.2大、小黄体细胞细微结构上的差异绵羊、牛和猪等家畜黄体组织中存在着两类形态和功能不同的黄体细胞，艮PLLC和 SLC;在猴黄体组织中也至少存在着两类可能存在三类

12、形态和功能不同的细胞。LLC具有均匀的核质，大量管状滑面内质网，大而多形态的线粒体，丰富的高尔 基复合体，伸入血管周围间隙的微管束、外周纤维终端网、不可提取的类脂滴和明显的 细胞间隙连接。而SLC细胞密度变化范围大，滑面和粗面内质网较少，高尔基复合体更 加极北，存在大量可提取的类脂滴，没有细胞间隙连接。大、小黄体细胞上激素受体的 数量也存在明显的差别。3.2.3黄体细胞中激素的定位黄体除了产生孕酮和雌激素外，还产生许多其他的激素，已发现有：OT，松弛素， 后叶激素运载蛋白，前列腺素及胰岛素如IGF-1 (胰岛素生长因子)有关黄体中OT的分 布情况前已述及。Field等用免疫酶化法经电镜观察证实

13、:在妊娠中的三期(the middle third of pregnancy)牛的大黄体细胞中存在松弛素。在猪也发现在发情周期和妊娠间 LLC的致密深染颗粒中存在松弛素，而在绵羊有关黄体中贮存松弛素的资料较少.松弛素 在妊娠末期特别是在分娩时发挥着重要作用，但有关松弛素的功能尚不清楚。07年，陈 树林老师等为了探查山羊卵巢黄体中是否存在弥散性神经内分泌细胞，采用免疫组化链 霉素抗生物素蛋白一过氧化物酶法对1218月龄妊娠奶山羊卵巢中弥散性神经内分泌 细胞标志物的分布进行了研究。结果显示：黄体组织中各区均含有催产素、神经元特异 性烯醇化酶(NSE)、S100蛋白、突触素(SYN)和5羟色胺(5H

14、T)样免疫反应阳性细胞 口1。3.2.4两型黄体细胞功能上的差异在家畜，基础孕酮分泌主要来自LLC;但LH在和腺昔酸环化酶作用下，产生大量 孕酮，这与LH受体大量存在于的结果一致LLC生成孕酮的能力主要受PGF2a调节，PGF2a 通过激活蛋白激酶，增加细胞内钙离子浓度，使细胞内代谢酶的活性降低抑制胆固2 醇的合成和胆固醇向孕酮的转化，并可能导致LLC自溶，产生细胞毒素而间接引起的 SLC变性和孕酮分泌的降低。人的LLC也较SLC分泌较多的基础孕酮;但LLC生成的孕酮仅为SLC的两倍，而这种差 异在羊和猴可达1230倍。和猴一样，人的黄体雌激素主要来源于LLC。在以雄激素为 底物时，两种细胞都

15、能合成雌酮和17b-E2，但由FSH诱导的芳香化却仅发生于LLC。一般 情况下,SLC生成较多的雄激素;受HCG刺激后，仅SLC孕酮分泌增加，同时雄烯二酮和肇 酮的分泌也增加；HCG对LLC无明显刺激作用I，”。90年代生殖生物学领域里的重要发现之一是反当动物绵羊、牛、山羊、鹿、猪、猴 和人黄体能分泌催产素。黄体分泌的催产素是调节子宫前列腺素和卵巢孕酮分泌的重要 因素，因此对调节发情或月经周期具有重要作用。以上多集中于实验动物和人的研究，迄今还未见有关山羊的黄体组织形态学与卵泡 生长发育的关系的研究。由于黄体是一个调节发情周期和维持妊娠的重要内分泌器官， 长期以来，有关黄体的生理学和神经内分泌

16、学研究一直受到重视。本实验室在前期开展 了下丘脑-垂体-卵巢轴催产素的分布研究中，结果表明在发情周期和妊娠期黄体组织中 均有催产素的分布，大、小黄体细胞均可出现阳性反应，但未能揭示阳性产物在两型黄 体细胞中的颗粒分布及差异；随后又开展的黄体中弥散神经内分泌细胞的相关研究显示 5-HT、NSE（神经元特异性烯醇化酶）和SYN（突触素）（注:三者可做为弥散性神经内分泌 系统的细胞标记物）共存于山羊黄体细胞中，而在黄体细胞以外的卵巢细胞中未观察到 该现象，说明羊的卵巢发生黄体化的同时也存在着部分细胞的神经内分泌化，但仍未明 确揭示这些标记物到底共存于哪一类型黄体细胞，也未说明在不同生理时期这些标记物 的分布变化。由此可见，有关黄体组织细胞构成、分型、各型结构特征、各型黄体细胞 中标记物是否存在以及存在的意义及对其它组织的影响等的认识对于黄体神经免疫内 分泌学研究及相关应用研究都有着十分重要的意义。本实验