实验室中固定液

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1、实验室中固定液、缓冲液配置 一、固定剂大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽 类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某 些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化 学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选 择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为 常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。1.4%多聚甲醛-O.1mol/L磷酸缓冲液（p

2、H7.3）试剂：多聚甲醛40gO.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500800ml 0.1mol/L磷酸缓冲 液（Phosphate Buffer以下简称PB）,加热至60C左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完 全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml， 充分混匀。该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定 224h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛40g蒸馏水400mlB 液

3、: Na2HPO4 2H2O16.88g蒸馏水300mlC 液: NaOH3.86g蒸馏水200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后 冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好 后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl将pH调至7.27.4,最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4C冰箱保存备用。该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制 的戊二醛，使其终浓度为0.5%1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于 该固定液中，4C冰箱保存

4、数月仍可获得满意的染色效果。3. Bouin s 液及改良 Bouin s 液试剂：饱和苦味酸75ml40% 甲醛250ml冰醋酸50ml配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后 存于4C冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin s液即不加冰醋酸。该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完 整。但因偏酸（pH为33.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本 的长期保存。此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。4. Zamboni s（Stefanini s）液试剂：多聚甲醛20g饱和苦味酸150ml

5、Karasson-Schwlt s PB至 1000ml配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60 C左右，持续搅拌使 充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt s PB至1000ml充分混合（Karasson - Schwlt s磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细 胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的 饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。固定时间为6 18h。5. PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多

6、聚甲醛固定液（Periodate-Lysine-paraform-alde hyde fixative）试剂：过碘酸钠赖氨酸盐酸盐（或盐酸赖氨酸）:多聚甲醛蒸馏水配制方法：（1）贮存液A （O.1mol/L赖氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4）：称取赖氨酸盐酸盐1.827g溶 于50ml蒸馏水中，得0.2mol/L的赖氨酸盐酸盐溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L,将 pH调至7.4,补足0.1mol/L的PB至100ml,使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4C冰箱保存，最好 两周内使用。此溶液的渗透浓度为300mOs mmol/L/kg。（2）贮存液B （8%多聚甲醛

7、溶液）：称8g多聚甲醛加入100ml蒸馏水中，配成8%多聚 甲醛液（方法见前）。过滤后4C冰箱保存。（3）临用前，以3份A液与1份B液混合，再加入结晶过碘酸钠（NalO4）,使NaIO4 终浓度为2%。由于AB两液混合，pH从约7.5降至6.2，故固定时不需再调pH值。固定时 间为618h。该固定剂较适于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。其机制是 借助于过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合，从而与糖形 成交联。由于组织抗原绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分, 故该固定剂有选择性地使糖类固定，这样既稳定了抗原，又不影响其在组织

8、中的位置关系。 Mclean和Nakane等认为，最佳的混合是：含0.01mol/L的过碘酸盐、0.075mol/L的赖氨酸、 2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸缓冲液。6. Karnovsky s 液（pH7.3）试剂：多聚甲醛30g25% 戊二醛80ml0.1mol/L PB至 1000ml配制方法：先将多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中，再加入戊二醛，最后加0.1mol/L的PB 至1000ml，混匀。该固定剂适于电镜免疫细胞化学，用该固定液在4C短时固定，比在较低浓度的戊二醛 中长时间固定能更好地保存组织的抗原性和细微结构。固定时最好先灌注固定，接着浸泡固 定1030min，

9、用缓冲液漂洗后即可树酯包埋或经蔗糖溶液后用于恒冷切片。7. 0.4% 对苯醌（Parabenzoquinone）0. 01mol/L PBS1000ml配制方法：称取4.0g对苯溶于1000ml 0.01mol/L的PBS即可。对苯醌对抗原具有较好的保护作用，但对超微结构的保存有一定影响，故常与醛类固定 剂混合使用。一般要求临用前配制，且避免加热助溶，因加热或放置时间过长，固定液变为 棕色至褐色，会使组织标本背景增加，影响观察。此外，对苯醌有剧毒，使用时避免吸入或 与皮肤接触。8. PFG 液（Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehyde fixat

10、ive, PFG）试剂：对苯醌20g多聚甲醛15g25% 戊二醛40ml0.1mol/L二甲酸钠缓冲液至1000ml配制方法:先以500ml左右的二甲酸钠缓冲液溶解对苯醌及多聚甲醛，然后加入戊二醛， 最后加入二甲酸钠缓冲液至1000ml充分混合。对苯醌与戊二醛及甲醛联合应用，即可阻止醛基对抗原的损害，又不影响超微结构的保 存，故适于多种类抗原的免疫细胞化学，尤其是免疫电镜的研究。9.碳二亚酰胺-戊二醛（ECD-G）液试剂：0.05mol/L PB 500ml0.01mol/L PBS500mlTris约 14g浓HCl少许ECD10g25% 戊二醛3.5ml配制方法：先以约500ml的PB与相

11、同体积的PBS混合，加入Tris （使其终浓度为1.4%） 溶解，以浓HCl调pH至7.0，再将事先称取好的ECD和戊二醛加入混合液，振摇后计时， 用pH计检测，约23min时，pH降至6.6,再以1N的NaOH在4min内调pH至7.0,此时, 将该混合固定液加入盛有细胞（经PBS漂洗过）的器皿中，在23C固定7min后，以PBS洗 去固定液，即可进一步处理。ECD 即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboi imide hydrochloride,简称乙基-CDI,常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质的固定也有 良好效果

12、。ECD单独应用时，边缘固定效应重，但与戊二醛、Tris及PB联合应用，效果明 显改善，细胞质仍可渗透，利用细胞中抗原的定位，超微结构保存较好。目前认为是一种用 于培养细胞电镜水平免疫细胞化学研究的很好的固定剂。10.四氧化锇(锇酸Osmic Acid, OsO4)配制：将洗净装有0s04的安瓿中加热后，迅速投入装有溶剂的棕色瓶中，使安瓿遇冷 自破。也可用钻石刀在安瓿上划痕，洗净后再放入瓶中，盖好瓶塞，用力撞击安瓿，待其破 后加溶剂稀释。为保证充分溶解，应在用前几天配制。(1) 2% OsO4水溶解：取OsO41g溶于重蒸水中。此液常作为储备液，于冰箱中密封保存。(2) 1% OSO4-PB：

13、试剂：A、2.26%NaH2PO4 2H2O4.15mlB2.52%8.5mlC、5.4%葡萄糖5mlD、OsO40.5g配制方法：先分别配好A、B、C三种液体，取A液41.5ml与B液8.5ml混合，将pH 调至7.37.4,取A-B混合液45ml再与5ml C液混合即为0.12mol/L PBG。(3) 1% OsO4/).1mol/L 二甲胂酸钠缓冲液(pH7.27.4)：试剂：2% OsO4水溶液10ml0.2mol/L二甲胂酸钠缓冲液(pH7.27.4)10ml配制方法：取2%OsO4储备液10ml与等量0.2mol/L、pH7.27.4的二甲胂酸钠缓冲液 充分混合即可。OsO4是电

14、镜研究所必需的试剂，常用于后固定。尽管OsO4主要为脂类固定剂，但也 可与肽类及蛋白质起作用，形成肽-蛋白质或肽-脂交联。过氧化物酶的反应产物经OsO4处 理后，电子密度增高，适于电镜研究。但由于OsO4的反应产物对光及电子有较明显的吸收 能力，因此在免疫细胞化学染色前常需去除，去锇在光镜水平常用1%的高锰酸钾，在电镜 水平则常用H2O2来处理。以上介绍了目前免疫细胞化学中常用的一些固定液。关于固定液种类还很多，如70% 90%的酒精、丙酮、醋酸酒精(含0.1%1%醋酸的70%90%的酒精等)，这些溶液都能促 使蛋白质凝固。它们最初只是光学显微镜通用的固定液，但在免疫细胞化学上用其它方法不 成

15、功时，也可试用。总之，掌握一个原则，免疫细胞化学中，含重金属的固定液禁用(但 Zenker-Formalin可进行短时的固定)。目前多数认为，对生物标本较好的固定措施是：用4C 的Karnovsky s液灌注固定1030min后，接着在pH7.3、0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液中 漂洗过液，这种短时冷固定处理，有助于超微结构和许多肽类抗原的保存。对其它较难保存 的抗原可尝试PFG、PLP及Zamboni s液等混合固定液。二、缓冲液免疫细胞化学中应用的缓冲液种类较多，即使是同种缓冲液，其浓度、pH、离子强度 等也常常不同。在此介绍几种最常用的缓冲液的配制。1. 0.2mol/L(pH7.4)磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer, PB)试剂：NaH2PO4 2H2ONa2HPO4 12H2O配制方法：配制时，常先配制0.2mol/L的NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4,两者按 一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液(PB),根据需要可配制不同浓度的PB和PBS。(1) 0.2mol/L 的 Na2HPO4；称取 Na2HPO4.12H2o 31.2g(或 NaH2PO4 H20 27.6g)加重 蒸水至10