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1、受精卵原核显微注射实验目的1 了解受精卵显微注射的基本原理及动物转基因制作过程2 掌握受精卵显微注射基本技术实验原理显微注射技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注 入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内，再通过胚胎移植 技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育，从而获得转基因 动物。它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不含有原核载 体 DNA 片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制 , 可达 100kb ；实验 周期相对比较短。由于显微注射技术直接对基因进行操作，整合率较高，因而是 目前建立转基因动物极为重要的方法。仪器、
2、材料和试剂（一）仪器和耗材：1. PN-30 拉针仪（Narishige）2. OLYMPUS SZX7 实体镜3. EG-400 磨针仪（Narishige）4. MF-900 锻针仪（ Narishige）5. OLYMPUS IX71 倒置显微镜6. Narishige 显微操作系统7. JM-250 电泳仪（大连捷迈）8 眼科手术器械及显微手术器械（ ROBOZ）9. 毛细玻璃管 G-100，GC-1（Narishige）10. 细胞培养箱（Heraeus）、超净工作台、塑料平皿等。（二）试剂1. 目的基因制备相关试剂1.1分子克隆相关试剂：TaqDNA聚合酶，DNA连接酶，各种内切酶
3、等1.2受精卵制备相关试剂：孕马血清（PMSG），人绒毛膜促性腺激素（HCG）, 透明质酸酶等1.3 转基因载体制备相关试剂1.3.1 细菌培养基(1) LB培养基(IL)： NaCl 10g, 酵母提取物5g,蛋白胨10g , pH7.0(2) 2xYT培养基(1L)： NaCl 5g,酵母提取物10g,蛋白胨16g1.3. 2 质粒提取溶液配制溶液I： L-葡萄糖 50mM, Tris-Cl(pH8.0) 25 mM, EDTA(pH8.0) 10mM, 121.5C 高压灭菌 20min。溶液 11( 100ml)： 1N NaOH 20ul, 10%SDS 10ml,水 90ml 现用
4、现配。溶液 111( 100ml)： 5mM 乙酸甲 60ml,冰乙酸 11.5ml，水 28.5ml。 1.4胚胎培养及注射缓冲液：胚胎培养液 M16(5.533g NaCl, 0.356g KCl, 0.252g CaCl22H2O, 0.162g KH2PO4, 0.293g MgSO47H2O, 2.101gNaHCO3, 2.610g Sodium lactate, 0.036g Sodium pyruvate, 1.00g Glucose, 4.00g BSA, 0.06g Penicillin G potassium salt, 0.05g Streptomycin sulfat
5、e, 0.01g Phenol Red,用三蒸水定容至1L),也可以用商品化的 M16培养基。受精卵操作培养液 M2 (5.533g NaCl, 0.356g KCl, 0.252g CaCl22H2O, 0.162g KH2PO4, 0.293g MgSO47H2O,0.349g NaHCO3, 4.969g HEPES, 2.610g Sodium lactate, 0.036g Sodium pyruvate, 1.00g Glucose, 4.00g BSA, 0.06g Penicillin G potassium salt, 0.05g Streptomycin sulfate,
6、0.01g Phenol Red,用三蒸水定容至 1L),也可以用商品化的M2培养基。注射缓冲液( 5-10mM tris-HCl pH7.4, 0.1-0.25mM EDTA)1.5 转基因鉴定相关试剂(1)核酸提取组织裂解液：TrisCl (pH7.4) 25mM, EDTA 100mM, SDS 0.5%, protease K 100ug/ml.(3) PCR鉴定试剂：TaqDNA聚合酶，dNTP,引物等方法与步骤(一)外源基因的制备及纯化 相对其他转基因方法来说,用于显微注射的载体构建简单,最典型的载体主 要包括：载体在细菌中扩增的相关元件(复制原点,筛选抗性基因等)；真核表 达相关
7、元件(启动子、增强子、目的基因、Poly A等)(如下图)为了增强目的基因表达，可在目的基因中引入内含子或者直接用含内含子的 基因组序列。为了提高目的基因整合的几率，在注射前需用限制性内切酶将载体 线性化并尽量去掉原核序列。另外，注射的用 DNA 的纯度要求比较高，不能有 微小颗粒和提取过程中有害杂质，否则会对细胞造成毒害，一般要求用 cscl 梯 度离心纯化。所用的TE的浓度比一般溶解DNA所的TE有所区别，该TE由5 10mmol Tris（pH7.4）和 0.1-0.25mM EDTA组成。注射用的DNA的浓度一般为1 3ug/ml，浓度高有助于提高目的基因的整 （1 ）根据所用的转基因
8、载体特点，选择特定的限制性核酸内切酶将包含完整真 核表达元件及目的基因的片段切下，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕在紫外灯下 将含目的转基因的片段的琼脂糖凝胶切下，操作时尽可能减少凝胶的体积。将所 得凝胶块放入透析袋中，电泳2-3小时使凝胶中的DNA片段完全游离出凝胶并 粘贴到透析袋壁上。去除透析袋中的凝胶块，将贴有DNA片段的透析袋放入到 新鲜的电泳液中再电泳3-5分钟，收集袋中含DNA片段溶液。（2）用 Tris-HCl 饱和酚抽提 DNA 溶液数次，以去除琼脂糖、蛋白等杂质，然 后用乙醚抽提3次，留下层液体。（3）用 2 倍体积无水乙醇沉淀 2-3 次， 70%乙醇洗 2-3 次，用 2.4
9、ml Tris-HCl（pH8.0）, 1mM EDTA溶解沉淀（至少需含5-10ug DNA），然后加入3g 超纯CsCl，待其充分溶解后，检测其密度是否是1.700.01g/ml，如果有差异, 可用CsCl或Tris/ EDTA缓冲液进行调整。（4）将调整好密度的溶液转移到1.3cmx5.0cm超速离心管中，然后加几滴石蜡 油封管， 40000rpm 室温离心 48h（Bekman SW50.1 转子），离心完毕，用针头 在离心管底部扎孔收集管底约0.2ml组份，另外抽取离心管中部组份，用琼脂糖 凝胶电泳进行鉴定是否含有DNA，最后将含DNA的组份与离心管底部组份合并。（5）收集到的DNA
10、溶液装入透析袋，于4C在大体积的注射缓冲液中透析48h, 期间换透析液 5-7 次。（6）将充分透析的DNA溶液经0.2um滤膜过滤除菌，电泳定量其浓度。按20ul/ 管分装冻存待用。（二）实验动物的繁育通常用于制作转基因小鼠的实验动物主要有近交系 C57BL/6J ， CBA/J、 C3H/HeJ、DBA/2J、SJL等以及远源杂交系CD1、KM等。制作过程中需要高质 量的供卵鼠、可育雄鼠、不育雄鼠以及假孕母鼠（代孕鼠），这些动物需要饲养 在湿度（50%-70%）和温度（19C-22C ）均可控且具有过滤系统的环境中，因 为光照时间对小鼠的性周期影响较大，繁育环境明暗周期一般控制为12h，为
11、早 6:00-晚 6:00。1 、受精卵供应鼠可选用 4 到 6 周龄的 C57BL/6JX CBA/J、C57BL/6JXSJL、C57BL/6JX C3H/HeJ、C57BL/6J X DBA/2J 及 C3H/HeJ X DBA/2J 等产生的 F1 代雌鼠，也 可以用4到6周CD1、KM等远源杂交系雌鼠。2、可育雄鼠可选用 8 周龄以上的 C57BL/6JX CBA/J、C57BL/6JXSJL、C57BL/6JX C3H/HeJ、C57BL/6JXDBA/2J 及 C3H/HeJXDBA/2J 等产生的 F1 代雄鼠，也可以用CD1、KM等远源杂交系雄鼠3、结扎雄鼠取 6 周左右的
12、C57BL/6JX CBA/J、C57BL/6JX SJL、C57BL/6JXC3H/HeJ、 C57BL/6JXDBA/2J 及 C3H/HeJXDBA/2J 等产生的 F1 代雄鼠或者 CD1、KM 等 远源杂交系雄鼠，按5ml/kg的剂量腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，待其完全麻 醉后，用虹膜组织剪剪去腹部被毛，用 75%酒精檫拭消毒，用虹膜剪在沿腹中 线靠近生殖器约1.5cm处开一约1cm长的开口，用弯头眼科镊子在腹腔内两侧 各找到白色的脂肪垫，夹着轻轻往外拉直到睾丸外露，在睾丸的下方可见输精管， 将另一眼科镊子在酒精等上烧红后夹住输精管，将其烧断。用同样的方法将另一 侧的输精管烧断。缝
13、和好创口，将小鼠保温安放，待其苏醒，术后一周，挑 2-4 只6周左右的雌鼠与之合笼，一个月后雌鼠未见怀孕则标志手术成功。4、代孕鼠由6周龄以上上述F1代雌鼠与结扎雄鼠交配所成。其性周期与受精卵供应 鼠保持一致。（三）受精卵的制备本实验选用 CD1 背景鼠作为实验小鼠，选取10只5-6周龄的雌性小鼠，于下午1:00-2:00按5IU/只腹腔注射孕马血清（PMSG）,46-48小时之后注射按5IU/只腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)。然后与可育雄鼠合笼交配，次日晨 选出有阴道栓的雌鼠准备取受精卵。因为外源基因注入原核者整合到染色体上的 比例最高，注人细胞质内的整合率很低。因此，取卵的时间应选在
14、卵子受精后， 雌雄原核已形成，但二者尚未结合的发育阶段为宜。取受精卵过程如下图：查栓 当天10:00-12:00 将有阴道栓的小鼠处死，经剥离后将用显微银子 将子宫系膜 与卵巢、子 宫分离撕开输卵管壶腹 部，释放受精卵, 透明质酸酶消化卵丘细胞围绕 受精卵形成的 细胞团完整的输卵管带一小段子宫剪下，置于 M2 培养液中，在解剖镜下找到输卵管的 膨胀壶腹部，用细尖头镊子撕开即见带有卵丘细胞的卵子自行流出。有时会遇到 受精卵已从壶腹部迁移到输卵管的狭窄部位，此时可用冲洗的办法。先准备 1 毫升注射器和已磨钝的4号注射针头，吸取预热37C的培养液，将取下的输卵 管置于6 厘米培养皿中，针头从喇叭口插
15、人，并用镊子轻轻夹住喇叭口固定针头 以防脱滑，这时慢慢地推动注射器即可见到卵子随培养液由子宫端流出。此法操 作方便且不丢失卵子。随后将带有卵丘细胞的受精卵移入含有 lmg/ml 透明质酸 酶(Hyaluronidase)的M2培养液内，溶去卵丘细胞，立即用预先拉制的吸管将卵 子吸至新鲜的M2培养液中洗涤2-3次，然后再将受精卵吸至另外新鲜M2培养 液中，如此进行4-5 次，直至视野中没有组织碎片和血细胞为止。最后将受精卵 吸至已经CO2平衡的M16培养液滴中（约50ul）,液滴上再覆盖一层胚胎级石 蜡油，放入培养箱中培养，待卵原核发育清晰饱满后即可做显微注射。整个实验 过程所用的解剖器械、玻璃
16、器皿、溶液等,均需灭菌以防污染。（四）代孕鼠的制备在供卵鼠与可育雄鼠合笼当天,挑选处于发情期的 CD1 雌鼠（6 周龄以上, 最好生育过）与结扎雄鼠合笼,第二天早上检查交配情况,标记有阴栓者,可做 代孕鼠。（五）显微注射系统的建立1、注射针的拉制选用外径为1mm,内径0.75-0.8mm带芯毛细玻璃管，装在水平拉针仪上， 拧紧左右两侧的夹子,做好固定,并使其中间部位对准加热丝。设定好电流、拉 力和时间。然后按开始键，等待毛细管被拉成两个所需的微注射针头。由于不同 厂家生产的玻璃毛细玻璃管参数存在细微差异，所以，不同厂家同一型号的玻璃 毛细玻璃管拉针参数组合不同，需要预先摸索。为了防止空气中灰尘颗粒沾染注射针引起针尖阻
