IEF使用过程中常见问题及解决方法

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1、精品可编辑IEF 使用过程中常见问题及解决方法IEF 在使用过程中可能会碰到的问题，详细情况请阅读说明书。如果操作错误或系统错误时， 相应的错误信息会显示在液晶屏上。 同时系统的电源供应会在 错误信息显示时自动切断。问题可能原因解决方法初始电流低或为零? IPG 胶条与电极接触不好.?检查IPG胶条与电极的接触情况，确保聚焦槽的盖子正确地合上 .? PROTEAN IEF 等电聚焦仪与聚焦? 检查聚焦盘的放置位置， 确保盘电极接触不完全.PROTEAN IEF等电聚焦仪与聚焦盘电极正确接触.在升压过程中电压不? IPG 胶条水化不完全?确保IPG胶条完全并平均地进行水化。检查水化液体积及水化时

2、间 .? 盐浓度过高? 检查盐浓度并对样品进行除上升 .电压未能达到预设电? Bio-Lyte 浓度过高? 将 Bio-Lyte 浓度降至 0.2%盐处理 .压或达到极限电压过(v/v).程非常缓慢? 对不同尺寸的 IPG 胶条和 pH 梯? 在聚焦时请用伏小时进行编程， 以确保样品的完全聚焦度电压设置过高.电压及电流波动很大 . （ 同时电阻错误信息会显示 ）问题烧胶条（这将会导致电阻较大的波动，并引起电阻错误信息显示 .）? 过多的样品在水化过程中未能进入胶条,或IPG胶条因过多的样品导致过度泡涨? IPG 胶条中有水化较差的区域IPG 胶条在运行过程中已经烧干? 限流过高 .可能原因?

3、限流过高 .? IPG 胶条已经烧干.? 电极处的滤纸过湿或含有不合适的电极溶液.? 水化缓冲液成份不合适, 盐浓度过高 .? 如果使用了超过了推荐的样品体积量，确保所有样品能进入胶条 , 或在聚焦前除去多余的样品液 .? 检查水化缓冲液体积及时间确保在水化期间水化缓冲液平均地分配 .?建议限流50科A .蕊保输入正确的IPG胶条数目.解决方法?建议限流 50科A/胶绥确保输入 正确的IPG胶条数目.?确保IPG胶条被矿物油或类似物所覆盖以防止胶条烧干? 确保滤纸电极只含有去离子水并且处于润湿状态而非潮湿状态.? 检查水化缓冲液浓度。必要时重新配制缓冲液.双向电泳实验中常见问题水平条纹出现的问

4、题:胶上出现连续性横纹。可能的原因:蛋白质没有完全和稳定溶解。推荐解决的方法:?用适当强烈的离液剂抽提蛋白，确保所有的蛋白质都溶解。因此选择合适浓度的尿素， 硫尿， 去污剂 ( e.g.CHAPS, ASB-14 ) ，两性电解质和还原剂( DTT or TBP )非常重要。每一种新的样品，都需要其相适应的样品处理方法。为处理好样品，现提供以下几个样品标准处理溶液：o8 -9 M urea, 4% (w/v) CHAPS, 2 mM TBP or 50 mMDTT, 40 mM Tris, 0.2% (w/v) Bio-Lyte 3/10Ampholyteo 7 M urea, 2 M thi

5、ourea, 4% (w/v) CHAPS, 2 mMTBP or 50 mM DTT, 40 mM Tris, 0.2% (w/v)Bio-Lyte 3/10 Ampholyte? 样品须有充分的溶解时间和变性时间。通常，在进行一相等电聚焦前，须将样品水化液在室温平衡1 小时左右。? 进行一相等电聚焦前，须对蛋白样品进行充分离心( 10,000rpm )，去除样品中的不溶的蛋白复合物。全蛋白 )推荐产品 : ReadyPrep protein extraction kit (total protein/出现的问题 : 出现不连续的横纹。可能的原因：样品中含有干扰物质，比如盐类，离子去污剂(S

6、DS),肽类,核酸类(e.g.DNA, RNA), 脂类,多糖和酚类化合物。推荐解决的方法: 以下是我们针对不同杂质推荐的不同去除方法。更详细的信息请参阅Rabilloud (1996 ) .盐：为确保IEF 顺利完成,样品中的总盐类不得超过40mM 。样品中的盐类物质可以通过透析,凝胶过滤,蛋白浓缩,或者蛋白沉淀后再复溶等方法减少或除去。 蛋白质沉淀可以选用 10%TCA 丙酮处理 ( Damerval etal. 1986 ) ,也可选用 ReadyPrep 2-D cleanup kit 。沉淀后，可以选用IEF/2-D 上样缓冲液重新溶解蛋白样品。注意在蛋白复溶前将沉淀试剂完全去除。阴

7、离子去污剂： SDS 是一种十分有效的去污剂，用于溶解难溶的蛋白。SDS 可以迅速使样品中的蛋白酶失活，并减少脂类物质对IEF 的影响。但是由于其强阴离子的特性会干扰一相等电聚焦， 因此在样品处理时就要注意其对样品的影响。 如果在样品制备中使用 SDS ， 那么在一相等电聚焦前， 须用含有过量兼性离子或中性离子的溶液稀释样品以降低 SDS的干扰。最终，样品中 SDS 的含量须低于0.25% (w/v) ，样品中其他去污剂和 SDS 之比至少应大于8 ： 1 。如果前述方法不足以去除样品中的SDS ，那么可以将蛋白质多步清洗后沉淀来清除SDS ，并用前面所介绍去除盐类物质的样品缓冲液重新溶解蛋白

8、质。核酸：处理培养细胞和从组织中分离的细胞时，往往造成很高的蛋白 /核酸比率。 核酸物质会增加样品的粘性， 并有可能堵住聚丙烯酰氨的孔，从而阻止蛋白渗入胶条，并会缓慢迁移形成条带。同时，核酸还会和蛋白通过离子间作用力结合， 造成假迁移使2-D 胶上出现横纹。 通常使用核酸内切酶酶解核酸是最为直接的方法。在样品中加入 0.1x solutioncontaining 1 mg/ml DNase I, 0.25 mg/ml RNase A, and 50 mMMgCl2 而后冰浴 (Blomberg et al. 1995). 注意： Mg 2+ 离子是DNase 活性所必须的。多聚糖类：同核酸一样

9、，高分子糖聚合物可能堵住胶孔从而影响IEF 。此外，高分子多糖如粘液素和右旋糖苷，因其所带的负电荷能和蛋白质作用， 从而在 2-D 胶上形成横条纹。 建议通过 TCA/ 丙酮沉淀 (Damerval et al. 1986) ； 或者醋酸铵沉淀后酚抽提(Hurkman and Tanaka 1986)；或者使用 ReadyPrep 2-D cleanup kit 处理样品。脂类： 蛋白质能和脂类通过疏水力互相作用， 在 2-D 胶上造成假象。 在水化液中，脂蛋白复合物可能完全不溶，也就不能渗进胶条中的聚丙烯酰氨凝胶中去。一个破坏脂-蛋白间作用力的方法就是提高去污剂的浓度有些样品在复溶前, 须用

10、有机溶剂破坏脂键，常用的是甲醇和氯仿的混合物 (Wessel and Flugge 1984)。酚类化合物：植物组织含有大量的酚类化合物，它们往往以氢键和蛋白质相互强烈作用。这些化合物有可能通过酶的催化使蛋白氧化，形成共价键修饰蛋白。酚类化合物的影响，可以通过以下方法去除。1. 酚类化合物可以被polyvinylpyrrolidone (PVP) orpolyvinylpolypyrrolidone (PVPP) 吸附。2. 样品制备中加入 DTT ，抗坏血酸，亚硫酸盐可以防止酚类氧化作用。3. 氧化酚类的酶可以被制备样品时所用裂解液中的硫尿所抑制。4. 裂解的液氮冻存的样品可以直接加入强变性

11、剂混合物 如 TCA/ 丙酮 (Damerval et al. 1986). ，可以抑制酚氧化。推荐产品 : ReadyPrep 2-D cleanup kitBio-Spin/Micro Bio-Spin 6 columns出现的问题可能的原因推荐解决的方法出现不连续的横纹。样品中含有干扰物质，比如盐类，离子去污剂(SDS),肽类,核酸类(e.g.DNA, RNA), 脂类,多糖和酚类化合物。以下是我们针对不同杂质推荐的不同去除方法。更详细的信息请参阅Rabilloud (1996 ) .盐：为确保IEF 顺利完成 ,样品中的总盐类不得超过 40mM 。样品中的盐类物质可以通过透析,凝胶过滤

12、 ,蛋白浓缩,或者蛋白沉淀后再复溶等方法减少或除去。 蛋白质沉淀可以选用 10%TCA 丙酮处理 ( Damerval etal. 1986 ) ,也可选用ReadyPrep 2-D cleanup kit 。沉淀后，可以选用IEF/2-D 上样缓冲液重新溶解蛋白样品。注意在蛋白复溶前将沉淀试剂完全去除。阴离子去污剂： SDS 是一种十分有效的去污剂，用于溶解难溶的蛋白。SDS 可以迅速使样品中的蛋白酶失活，并减少脂类物质对IEF 的影响。但是由于其强阴离子的特性会干扰一相等电聚焦， 因此在样品处理时就要注意其对样品的影响。 如果在样品制备中使用 SDS ， 那么在一相等电聚焦前， 须用含有过

13、量兼性离子或中性离子的溶液稀释样品以降低 SDS的干扰。最终，样品中 SDS 的含量须低于0.25% (w/v) ，样品中其他去污剂和 SDS 之比至少应大于8 ： 1 。如果前述方法不足以去除样品中的SDS ，那么可以将蛋白质多步清洗后沉淀来清除SDS ，并用前面所介绍去除盐类物质的样品缓冲液重新溶解蛋白质。核酸：处理培养细胞和从组织中分离的细胞时，往往造成很高的蛋白 /核酸比率。 核酸物质会增加样品的粘性， 并有可能堵住聚丙烯酰氨的孔，从而阻止蛋白渗入胶条，并会缓慢迁移形成条带。同时，核酸还会和蛋白通过离子间作用力结合， 造成假迁移使2-D 胶上出现横纹。 通常使用核酸内切酶酶解核酸是最为

14、直接的方法。在样品中加入 0.1x solutioncontaining 1 mg/ml DNase I, 0.25 mg/ml RNase A, and 50 mMMgCl2 而后冰浴 (Blomberg et al. 1995). 注意： Mg 2+ 离子是DNase 活性所必须的。多聚糖类：同核酸一样，高分子糖聚合物可能堵住胶孔从而影响IEF 。此外，高分子多糖如粘液素和右旋糖苷，因其所带的负电荷能和蛋白质作用， 从而在 2-D 胶上形成横条纹。 建议通过 TCA/ 丙酮沉淀 (Damervalet al. 1986) ； 或者醋酸铵沉淀后酚抽提(Hurkman and Tanaka 1986)；或者使用 ReadyPrep 2-D cleanup kit 处理样品。脂类： 蛋白质能和脂类通过疏水力互相作用， 在 2-D 胶上造成假象。 在水化液中，脂蛋白复合物可能完全不溶，也就不能渗进胶条中的聚丙烯酰氨凝胶中去。一个破坏脂- 蛋白间作用力的方法就是提高去污剂的浓度有些样品在复溶前, 须用有机溶剂破坏脂键，常用的是甲醇和氯仿的混合物 (Wessel and Flugge 1984