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1、基于碳纳纳米管的的安培型型H2O2生物传传感器的的研究麦智彬 邹小小勇*(中山大大学化学学与化学学工程学学院，广广州：55102275)摘要利用用阳离子子染料硫硫堇（TThiooninne, Thii）作为为介体同同时结合合多壁碳碳纳米管管（MWWNTss）、壳壳聚糖（CChittosaan, CHIIT），辣辣根过氧氧化酶（HHorsseraadissh pperooxiddasee, HHRP）的混合包埋物制作H2O2生物传感器。通过循环伏安法、计时电流法对传感器的性能进行研究。结果表明所得传感器具有明显的增敏效应，线性范围为30mol/L5.5mmol/L，相关系数为0.9995。在S/
2、N=3的情况下，检出限为19mol/L。所得的传感器具有良好的稳定性及工作寿命。关键词碳碳纳米管管硫堇壳聚聚糖辣根根过氧化化酶过氧氧化氢1 引言H2O22是过氧氧化酶参参与的酶酶促反应应产物，它它的测定定对于食食品、药药物和环环境分析析等具有有重要意意义。迄迄今为止止，H22O2的测定定方法包包括光谱谱法1，化学学荧光分分析法2，滴定定分析法法3以及电电化学分分析法4。其中中电化学学分析法法由于具具有较高高的灵敏敏度，良良好的线线性范围围，快速速而稳定定的响应应信号而而被广泛泛研究。碳纳米管管（CNNTs）发现于于19991年5，其独特特的理化化性质使使之广泛泛地应用用在生物物传感器器的研究究
3、之中。目前国内外已有多篇有关CNTs生物传感器的综述6-7。本文首次利用Thi作为介体结合CHIT、MWNTs和HRP的混合包埋物制作H2O2传感器，利用循环伏安法（CV），计时电流法（I-t）对传感器的工作机理、性能及寿命进行了研究。2 实验部分分2.1 试剂HRP购购自国药药集团化化学试剂剂有限公公司(RRZ2250 uniits/mg)。CHHIT购购自上海海伯奥生生物科技技有限公公司，脱脱乙酰度度为999%。HH2O2（300% ww/v溶溶液）购购自广州州化学试试剂厂。羧羧基化的的MWNNTs购购自深圳圳纳米港港公司，纯纯度大于于90，直接接使用。其其它试剂剂均为分分析纯。0.1mm
4、ol/L的Thi溶液用0.05mol/LpH6.5的PBS溶液配制。1%的CHIT溶液用醋酸溶液配制。其余溶液用超纯水配制。2.2 仪器CHI6660AA型电化化学工作作站（上上海辰华华仪器公公司）以以及三电电极系统统：H22O2传感器器为工作作电极，铂铂丝为辅辅助电极极，Agg/AggCl为为参比电电极。扫描电镜镜（SEEM）照照片采自自日本电电子株式式会社场场发射扫扫描电子子显微镜镜（型号号：JSSM-663300F），透透射电镜镜（TEEM）照照片采自自日本电电子株式式会社透透射电子子显微镜镜（型号号：JEEM-220100HR）。红红外光谱谱采用德德国Brrukeer公司司傅里叶叶变换
5、红红外光谱谱-红外外显微镜镜联用仪仪（型号号：EQQUINNOX 55）制制作。本实验是中山大学化学与化学工程学院创新实验与研究资金(No.24)资助项目1552.3 传感器的的制作玻碳电极极（GCC, =4mmm）分别别在载有有1.00、0.3、00.055m的AAl2O3颗粒的的绒毛垫垫上抛光光处理后后，用超超纯水冲冲洗干净净，依次次在1:1 HHNO33、无水水乙醇及及超纯水水中超声声处理各各两分钟钟，自然然晾干后后备用。5%的NNafiion用用无水乙乙醇稀释释至0.5%。55L 00.5%的Naafioon滴加加在电极极表面，自自然晾干干，得NNafiion修修饰电极极（GCC/Na
6、af）。GGC/NNaf在在0.11mmool/LL的Thhi水溶溶液中浸浸泡100minn，在此此过程中中，Naafioon和TThi通通过静电电作用充充分结合合。静电电吸附TThi后后的电极极用二次次水彻底底洗去弱弱吸附的的Thii分子，晾晾干后得得传感器器底层（GGC/NNaf/Thii）。1mg MWNNTs在在1%的的CHIIT中超超声处理理15mmin后后得到11mg/mL的的MWNNTs-CHIIT。110L MMWNTTs-CCHITT与5L100mg/mLHHRP均均匀混合合后，取取其中88L覆盖盖在传感感器底层层上，44下干燥燥24hh，得HH2O2传感器器（GCC/Naa
7、f/TThi/MWNNTs-HRPP-CHHIT），整个个传感器器的制作作过程如如图1所示。图1 HH2O2传感器器制作流流程图2.4 实验方法法所有实验验在0.05 moll/L pH66.5 PBSS中进行行。电解解池中加加入0.6mLL底液，然然后加入入不同体体积H22O2储备液液进行电电化学测测定。循环环伏安曲曲线在溶溶液静止止状态下下测定，计计时电流流法实验验在搅拌拌状态下下进行。3 结果与讨讨论3.1 MWNTTs的物物理表征征MWNTTs在11% CCHITT中的分分散状况况如图22C所示。分分别考察察MWNNTs在在水及11% CCHITT中分散散30天天后的状状况，研研究发现
8、现MWNNTs在在水中已已出现明明显的聚聚沉现象象，而在1% CHHIT中中仍分散散良好。因因此与水水相比，11% CCHITT对MWWNTss具有更更稳定的的分散能能力。从MWNNTs的的SEMM（图22A）可可以很好好地观察察到MWWNTss的管状状结构。而而由TEEM（图图2B）可判判断出MMWNTTs的直直径范围围为820nnm。同时利用用FT-IR表表征了MMWNTTs功能能化前后后表面官官能团（图图2D）的状状况。结结果表明明功能化化后的MMWNTTs在117100和15568ccm-11有明显显的吸收收峰。另另外34440ccm-11和11885cmm-1的吸吸收峰分分别归属属于
9、-OOH和CC-OHH的弯曲曲吸收振振动。由由这些吸吸收峰可可以推知知，MWWNTss的表面面被部分分氧化为为羧基和和羟基。(A) (B)(C)(D)图2 MWNNTs的的物理表表征（A为MMWNTTs的SSEM图图、B为MWWNTss的TEEM图、C为MWNTs分别在水和1%CHIT中分散30天后分散效果对比、D为羧基化前后MWNTs的IR图）3.2 传感器的的电化学学性质利用循环环伏安法法研究了了传感器器的电化化学性质质如图3所示。传传感器在在底液里里（图33c）有一一对准可可逆峰（Ea=-0.137V, Ipa-1.668A; Ec-0.212V, , Ipc1.668A; E=75mV
10、），该峰归属于Thi在电极表面的氧化还原。与GC/Naf/Thi（图3a）相比（Ea=-0.146V, Ipa-8.672A; Ec-0.231V, , Ipc6.203A; E=85mV），传感器的氧化及还原峰电流均有所下降，而可逆性增加。这是由于包埋MWNTs-CHIT-HRP后导致传感器的阻抗增大，但MWNTs特殊的空间效应和催化能力又促进了传感器内部介体的电子传递，使Thi的氧化还原电对的可逆性增加。在21mmol/LH2O2的存在下（图3b），Thi的还原峰电流明显地增加。H2O2与生物传感器的反应机理如下所示：H2O22+HRRPHH2O+HHRP-I (1)HRP-I+LLTHH
11、RPP-III+THH(22)HRP-II + TTHHRPP + TH+(3)TH+H+2eeLTTH2(4)HRP首首先将HH2O2还原为为H2O，自身身氧化为为HRPP-I（11）。HHRP-I被白白硫堇（LLTH）进进一步氧氧化成HHRP-II（22），之之后在硫硫堇自由由基（TTH）的存存在下HHRP-II被被还原为为HRPP，失去去电子后后的THH转变成成TH+，在酸酸性条件件下得到到电子重重新还原原LTHH2，所以以传感器器在H2O2的存在在下还原原峰电流流增加。图3生物物传感器器对211mmool/LL H2O2响应的的循环伏伏安图3.3 实验条件件的优化化通过一系系列实验验对
12、传感感器的实实验条件件进行了了优化，结结果如表表1所示。在在以后的的定量分分析中，均均采用表表1的选选择值作作为实验验条件。表1实验验条件参参数优化化表参数测量范围围选择值静电吸附附时间/minn515510扫描速率率/(mmV/ss)20110050工作电位位/V0-00.400-0.222pH5.98.006.5HRP用用量/uunitts1963.4 传感器工工作机理理探讨及及在定量量分析中中的应用用3.4.1传感感器工作作机理探探讨为了探讨讨MWNNTs、HHRP对对传感器器响应信信号的贡贡献，利利用计时时电流法法分别考考察了(A)GGC/NNaf/Thii/MWWNTss-HRRP-
13、CCHITT；(B)GC/Naff/Thhi/HHRP-CHIIT；(C)GC/MWNNTs-CHIIT对00.5mmmoll/L H2O2的响应应情况，结结果如图图4所示。由由图可知知，IAAIIB+IC，传感器器具有明明显的增增敏效应应。增敏敏现象可可以从几几方面来来考虑：一方面面HRPP可以有有效地吸吸附在MMWNTTs管壁壁上8，由于于MWNNTs具具有较大大的比表表面积，电电极表面面的活性性位点增增多；另另一方面面MWNNTs也也可以利利用其独独特的三三维网络络结构深深入HRRP的活活性中心心9，促进进酶与电电极的电电子传递递，减少少HRPP外层多多肽的阻阻抗；另另外，MMWNTTs
14、较大大的比表表面积也也可以对对H2O2起到富富集作用用；同时时，注意意到GCC/Naaf/TThi/MWNNTs-CHIIT对HH2O2仍有部部分响应应（图55），MMWNTTs对H2O2具有催催化作用用，促使使H2O2还原的的过电位位下降。总总的来说说，传感感器的增增敏作用用受到以以上几个个因素的的协同效效应的影影响，涉涉及到MMWNTTs在传传感器中中的空间间效应及及电子效效应。图4传感感器不同同组分对对0.55mmool/LL H2O2图5 GC/Naff/Thhi/MMWNTTs-CCHITT对响应信号号的贡献献0.55mmool/LL H2O2的响应应3.4.2传感感器的工工作曲线线
15、及米氏氏常数利用计时时电流法法考察了了传感器器对H22O2的响应应情况（图图6）。结果果表明，传传感器的的对H2O2具有快快速的响响应，信信号达到到95%所需的的时间小小于6ss，且在H2O2浓度为为30moll/L5.55mmool/LL的范围围内呈线线性响应应，方程程为Cuurreent/A= 4.227210-88+ 7.040010-44C/(mmol/L)，相相关系数数为0.99995。同同时，根根据Liinewweavver-Burrk方程程10：1/Isss11/Imaxx+KMappp/ImaxxC（式中IIss为加加入底物物后的电电流强度度，C为底物物浓度，Imax为固定底物浓度后的最大电流，KMapp为米氏常数。）用双倒数法求得米氏常数为1.93mmol/L（图7）。从图形意义上来说，米氏常数为检测上限和检测下限的中点位置，而本文所求得的米氏常数与该理论非常吻合，说明在该浓度范围内，传感器的反应属于一级反应动力学过程。传感器对对0.11mmool/LL的H22O2分别进进行了88次测量量，求得得R.
